單一中藥提取物對(duì)大腸桿菌和沙門氏菌的體外抑菌效果研究

趙鈺涵，冀紅芹，張文晶，王忠順，孟令楠*

（ 1. 沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué)，遼寧 沈陽(yáng) 110000 ； 2. 遼寧農(nóng)業(yè)職業(yè)技術(shù)學(xué)院，遼寧 營(yíng)口 115007 ）

中草藥在畜牧業(yè)中的應(yīng)用具有悠久的歷史，早在兩千多年前已有關(guān)于用中草藥促進(jìn)動(dòng)物生長(zhǎng)、增重和防治疾病的文字記載。近些年關(guān)于中草藥體外抑菌的報(bào)道有很多，李美發(fā)等[1]使用黃芪、何首烏、黃連、金銀花、大黃、白頭翁、五倍子、葛根等8種中草藥的提取液，對(duì)3種育肥豬常見的有害腸道菌株抑菌圈的大小和最小抑菌濃度（MIC）進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果顯示，單一添加黃芪、黃連和大黃等3種中草藥對(duì)大腸桿菌、沙門氏菌和金黃色葡萄球菌體外抑菌效果較好。董曉龍等[2]取28 種中草藥，研究其對(duì)4 種大腸桿菌菌株（血清型O78、血清型O41、血清型O24、血清型O1+O148）的體外抑菌效果，篩選出了秦皮、厚樸、黃芩、苦參、黃連、穿心蓮、馬齒莧、魚腥草、白頭翁和大青葉等10種對(duì)大腸桿菌抑菌效果較好的中藥。隨著禁抗政策的實(shí)施以及耐藥菌株不斷增加的發(fā)展趨勢(shì)，中草藥成為臨床治療畜禽疾病的新研究方向。本試驗(yàn)通過煎煮法和醇提法兩種方式獲得的中草藥提取物研究其對(duì)雞致病性大腸桿菌和沙門氏菌的體外抑菌效果，以期為中草藥應(yīng)用于畜禽細(xì)菌性疾病的臨床防治提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 菌種與培養(yǎng)基

試驗(yàn)所用大腸桿菌、沙門氏菌由遼寧省蛋雞健康養(yǎng)殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供。

營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、LB肉湯培養(yǎng)基常規(guī)配制。

1.1.2 試驗(yàn)藥品魚腥草、連翹、五倍子、紫花地丁、金銀花、蒲公英、板藍(lán)根、黃連均購(gòu)自鲅魚圈區(qū)新誠(chéng)達(dá)藥店。

1.1.3 試驗(yàn)儀器

電子分析天平、離心機(jī)（湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開發(fā)有限公司）；無菌操作臺(tái)（廣州市康恒儀器有限公司）；恒溫培養(yǎng)箱（上海幕斯實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司）；高壓蒸汽滅菌鍋（合肥華泰醫(yī)療設(shè)備有限公司）；振蕩培養(yǎng)箱（廣州市康恒儀器有限公司）。

1.2 中草藥提取液制備

1.2.1 煎煮法制備中草藥提取液

本試驗(yàn)采取煎煮法進(jìn)行制備中藥提取液。使用電子天平分別稱取中草藥50 g，用清水清洗干凈，在燒杯中加入500 mL蒸餾水浸泡2 h，分別放入砂鍋中加熱，大火煮沸后改為慢火煮30 min，紗布過濾后再將藥渣使用同樣的方法進(jìn)行處理，重復(fù)兩次，4 000 r/min離心10 min取上清液，濃縮后藥液濃度為1 g/mL[3-4]。用試劑瓶裝好并標(biāo)記，高壓滅菌后備用。

1.2.2 乙醇浸提法制備中草藥提取液

稱取中草藥各50 g，粉碎，加5倍量95%乙醇，浸泡3 d后過濾，藥渣再加5倍量95%乙醇浸泡3 d，過濾，合并兩次濾液，55 ℃蒸餾回收乙醇，并使濾液濃縮至藥液濃度為1 g/mL，在4 ℃的冰箱中保存[5]。

1.3 菌懸液的制備

將大腸桿菌與沙門氏菌分別劃線接種于營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，37 ℃恒溫培養(yǎng)24 h 后，挑取單個(gè)活化菌落活，加入LB營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中制成菌懸液，配置成1×106CFU/mL的菌懸液用于測(cè)定MIC及最小殺菌濃度（MBC）。

1.4 中藥提取液的抑菌效果測(cè)定

開展單味中草藥對(duì)大腸桿菌和沙門氏菌的抑菌及殺菌效果的研究，主要通過兩種不同的提取方法（煎煮法和乙醇浸提法）獲得中藥提取物。獲得中藥提取物后采用瓊脂平板打孔法進(jìn)行大腸桿菌和沙門氏菌抑菌圈直徑的測(cè)定[6-9]（大于20 mm 為極度敏感，15～20 mm 為高度敏感，10～15 mm為中度敏感，小于等于10 mm為低度敏感，“—”為無抑菌圈）以及MIC、MBC的測(cè)定[10-14]。

2 結(jié)果與分析

2.1 單味中草藥對(duì)大腸桿菌的抑菌效果（見表1、表2）

表1 單味中草藥提取液對(duì)大腸桿菌的抑菌效果（煎煮法）Tab.1 Antibacterial effect of single Chinese herbal medicine extract on Escherichia coli (decoction method)

表2 單味中草藥提取液對(duì)大腸桿菌的抑菌效果（乙醇提取法）Tab.2 Antibacterial effect of single Chinese herbal medicine extract on Escherichia coli (ethanol extraction method)

由表1 可知，大腸桿菌對(duì)于8 種煎煮法提取的單味中草藥表現(xiàn)出了不同的敏感性，其中大腸桿菌對(duì)于蒲公英提取物表現(xiàn)為極度敏感，抑菌圈的直徑為22.27 mm；對(duì)五倍子提取物為高度敏感，抑菌圈的直徑為16.25 mm；對(duì)魚腥草、連翹、紫花地丁、金銀花、板藍(lán)根均表現(xiàn)為中度敏感，抑菌圈的直徑分別為12.25、13.87、14.98、12.33、13.58 mm；對(duì)黃連提取物表現(xiàn)為低敏，抑菌圈的直徑為8.24 mm。蒲公英提取物的MIC、MBC 分別為9.65 、15.66 g/L；五倍子提取物的MIC、MBC 分別為62.25、64.15 g/L；魚腥草提取物的MIC、MBC分別為15.63、31.25 g/L；連翹提取物的MIC、MBC 分別為25.43、43.25 g/L；紫花地丁提取物的MIC、MBC 分別為250.00、250.00 g/L；金銀花提取物的MIC、MBC 分別為250.00、250.00 g/L。板藍(lán)根提取物的MIC、MBC 分別為250.00、250.00 g/L；黃連提取物的MIC、MBC分別為15.83、31.25 g/L。

由此可知，煎煮法所得的蒲公英提取物對(duì)大腸桿菌的抑菌和殺菌效果最強(qiáng)，其次是五倍子提取物，而魚腥草、連翹、紫花地丁、金銀花提取物對(duì)大腸桿菌的抑菌和殺菌效果相較前兩種略微遜色，黃連提取物對(duì)大腸桿菌的抑菌效果較差。

由表2 可知，大腸桿菌對(duì)于乙醇提取法得到的五倍子提取物表現(xiàn)為極度敏感，抑菌圈的直徑為23.60 mm；對(duì)魚腥草為高度敏感，抑菌圈的直徑為17.88 mm；對(duì)板藍(lán)根、黃連提取物表現(xiàn)為中度敏感，抑菌圈的直徑為14.68、12.66 mm；對(duì)連翹、紫花地丁、金銀花、蒲公英均表現(xiàn)為低敏，抑菌圈的直徑分別為9.10、8.55、7.55、6.41 mm。五倍子提取物的MIC、MBC 分別為17.66、33.16 g/L；魚腥草提取物的MIC、MBC 分別為31.75、62.75 g/L；連翹提取物的MIC、MBC 分別為11.50、19.46 g/L；紫花地丁提取物的MIC、MBC 分別為500.00、500.00 g/L；金銀花提取物的MIC、MBC 分別為500.00、500.00 g/L；蒲公英提取物的MIC、MBC分別為62.75、65.46 g/L；板藍(lán)根提取物的MIC、MBC分別為31.75、62.25 g/L；黃連提取物的MIC、MBC分別為125.00、125.00 g/L。

綜上所述，乙醇提取法所得的五倍子提取物對(duì)大腸桿菌的抑菌和殺菌效果最強(qiáng)，其次是魚腥草提取物，之后是板藍(lán)根和黃連提取物，而連翹、紫花地丁、金銀花、蒲公英提取物對(duì)大腸桿菌的抑菌效果較差。

2.2 單味中草藥對(duì)沙門氏菌的抑菌效果（見表3、表4）

表3 單味中草藥提取物對(duì)沙門氏菌的抑菌效果（煎煮法）Tab.3 Antibacterial effect of single Chinese herbal medicine extract on Salmonella (decoction method)

表4 單味中草藥提取物對(duì)沙門氏菌的抑菌效果（乙醇提取法）Tab.4 Antibacterial effect of single Chinese herbal medicine extract on Salmonella (ethanol extraction method)

由表3 可知，沙門氏菌對(duì)煎煮法提取的五倍子提取物表現(xiàn)為極度敏感，抑菌圈的直徑為27.38 mm；對(duì)板藍(lán)根提取物表現(xiàn)為中度敏感，抑菌圈的直徑為13.46 mm；對(duì)魚腥草、連翹、紫花地丁、金銀花、蒲公英、黃連均表現(xiàn)為低敏，抑菌圈的直徑分別為7.12、9.88、8.98、9.98、6.98、9.25 mm。五倍子提取物的MIC、MBC 分別為33.75、34.25 g/L；魚腥草提取物的MIC、MBC 分別為31.25、31.30 g/L；連翹提取物的MIC、MBC 分別為250.00、250.00 g/L；紫花地丁提取物的MIC、MBC 分別為100.00、100.00 g/L；金銀花提取物的MIC、MBC分別為500.00、500.00 g/L；板藍(lán)根、蒲公英提取物則無殺菌作用；黃連提取物的MIC、MBC 分別為62.50、100.00 g/L。

綜上，煎煮法所得的五倍子提取物對(duì)沙門氏菌的抑菌和殺菌效果最強(qiáng)，其次是板藍(lán)根，而魚腥草、連翹、紫花地丁、金銀花、蒲公英等對(duì)沙門氏菌的抑制效果較差。

由表4 可知，沙門氏菌對(duì)于乙醇提取法得到的五倍子提取物表現(xiàn)為極度敏感，抑菌圈的直徑為23.88 mm；對(duì)連翹、紫花地丁、板藍(lán)根、黃連提取物為中度敏感，抑菌圈的直徑為10.68、12.58、11.26、10.62 mm；對(duì)魚腥草、金銀花、蒲公英提取物為低敏，抑菌圈的直徑為7.22、9.25、6.58 mm。五倍子提取物的MIC、MBC 分別為17.66、33.16 g/L；連翹提取物的MIC、MBC 分別為13.25、19.48 g/L；紫花地丁提取物的MIC、MBC 分別為500.00、500.00 g/L；板藍(lán)根提取物的MIC、MBC 分別為33.24、64.75 g/L；黃連提取物的MIC、MBC 分別為100.00、100.00 g/L；魚腥草提取物的MIC、MBC 分別為35.25、68.75 g/L；金銀花提取物的MIC、MBC 分別為500.00、500.00 g/L；蒲公英提取物的MIC、MBC 分別為58.65、64.88 g/L。

由試驗(yàn)結(jié)果可知，乙醇提取法所得的五倍子提取物對(duì)沙門氏菌的抑菌和殺菌效果最強(qiáng)，其次是連翹、紫花地丁、板藍(lán)根、黃連提取物，而魚腥草、金銀花、蒲公英提取物對(duì)沙門氏菌的抑菌和殺菌效果較差。

3 討論

本試驗(yàn)結(jié)果顯示，綜合8 種中草藥單味提取物對(duì)雞致病性大腸桿菌的抑菌效果，煎煮法得到的單味中草藥提取物中，蒲公英提取物對(duì)大腸桿菌抑菌效果最強(qiáng)，五倍子次之；醇提法得到的單味中草藥提取物中，五倍子提取物對(duì)大腸桿菌最為敏感，魚腥草次之，蒲公英則表現(xiàn)為低度敏感。同種中草藥采取不同提取方式的提取液對(duì)同一菌種的抑菌效果不同，原因可能是不同提取方式和溶劑所提取出的抑菌有效成分不同。本研究結(jié)果和王雅如等[15]試驗(yàn)結(jié)果一致，究其原因可能與抑菌物質(zhì)在溶劑中的溶解度、提取溫度與時(shí)間有關(guān)。

本研究結(jié)果顯示，8 種中草藥單味提取物對(duì)沙門氏菌的抑菌效果中，煎煮法得到的五倍子提取物抑菌效果最好，其他中藥敏感性均不高；醇提法得到的五倍子提取物依然敏感性最高，紫花地丁等單一中藥呈中度敏感。綜上所述，同一種中藥采取相同的提取方法對(duì)不同病原菌的抑菌效果也不相同，這可能跟病原菌菌體結(jié)構(gòu)、組成成分的有關(guān)，從而表現(xiàn)出抑菌效果的差異性。

4 結(jié)論

本試驗(yàn)采取兩種不同的中藥提取方法，研究8 種中草藥單味提取物對(duì)大腸桿菌和沙門氏菌的體外抑菌效果。試驗(yàn)結(jié)果表明，8 種中草藥對(duì)大腸桿菌和沙門氏菌均具有不同程度的抑制效果，對(duì)大腸桿菌的抑制效果比沙門氏菌的抑制效果更好。其中，五倍子提取物對(duì)于大腸桿菌和沙門氏菌均具有不錯(cuò)的抑菌效果。