PELP1、SETDB1在卵巢癌組織中的表達(dá)及意義*

黃吉仁,李長江,毛艷華,張文文,王 佳,謝樂樂,張應(yīng)鳳

(重慶醫(yī)科大學(xué)附屬大學(xué)城醫(yī)院婦產(chǎn)科,重慶 401331)

卵巢癌是常見的婦科惡性腫瘤之一,其高發(fā)年齡集中在50歲以上,病死率居?jì)D科惡性腫瘤首位,在女性所有腫瘤相關(guān)死亡原因中排名第五[1-3],嚴(yán)重影響女性的身心健康。目前卵巢癌的治療方案為手術(shù)+化療,但存在易復(fù)發(fā)及耐藥等問題[4]。近年來,隨著對(duì)卵巢癌發(fā)生、發(fā)展機(jī)制的深入研究,靶向精準(zhǔn)治療能有效降低復(fù)發(fā)率、提高生存率,但能接受靶向治療的人群相對(duì)局限,且亦存在復(fù)發(fā)及耐藥等問題,仍需尋找新的分子靶點(diǎn)[5-6]。組蛋白甲基化參與了多種惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展,深入研究該過程的調(diào)控有望成為卵巢癌靶向治療的新突破口[7-8]。

脯氨酸-谷氨酸-亮氨酸富集蛋白1(proline-,glutamic acid- and leucine-rich protein 1,PELP1)是多種轉(zhuǎn)錄因子及核受體的共調(diào)節(jié)劑。PELP1基因是激素依賴性腫瘤如乳腺癌、卵巢癌、子宮內(nèi)膜癌等的原癌基因[9-12]。SET結(jié)構(gòu)域分支型組蛋白賴氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶1(SET domain bifurcated histone lysine methytransferase 1,SETDB1)是一種甲基轉(zhuǎn)移酶,它能夠使組蛋白H3K9位點(diǎn)發(fā)生甲基化,影響基因的表達(dá),進(jìn)而介導(dǎo)腫瘤的發(fā)生[13-14]。已有研究證實(shí),SETDB1在肺癌、乳腺癌、卵巢癌等多種惡性腫瘤組織中過度表達(dá),發(fā)揮致癌作用[15-17]。由于組蛋白修飾過程具有可逆性[18],SETDB1有望成為治療癌癥的重要靶點(diǎn)。LIU等[19]關(guān)于乳腺癌激素治療耐藥性形成的一項(xiàng)研究中證實(shí),PELP1與SETDB1存在相互作用。本研究旨在探索PELP1、SETDB1在卵巢癌組織及卵巢癌細(xì)胞系中的表達(dá)情況,分析與患者臨床病理特征之間的聯(lián)系,初步探討兩者在卵巢癌發(fā)生、發(fā)展過程中的作用,以期為臨床上卵巢癌患者的基因靶向治療提供新思路,現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

收集2016年7月至2022年5月本院婦產(chǎn)科行手術(shù)治療且臨床病理資料完整的35例卵巢癌患者組織標(biāo)本,按2014年國際婦產(chǎn)科聯(lián)盟(International Federation of Gynecology and Obstetrics,FIGO)手術(shù)病理分期標(biāo)準(zhǔn)分為Ⅰ～Ⅱ期16例、Ⅲ～Ⅳ期19例,另選取同期收治因子宮肌瘤行子宮及雙側(cè)附件切除術(shù)的17例患者的正常卵巢組織作為對(duì)照。所有患者的組織標(biāo)本均經(jīng)病理檢查明確診斷,所有患者術(shù)前均未行放化療、生物治療及內(nèi)分泌治療。本研究經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)審查通過(批準(zhǔn)編號(hào):LL-202240)。

1.2 方法

1.2.1主要試劑

RNA提取試劑 TRIzol購自寶生物工程(大連)有限公司;超微量紫外分光光度計(jì)購自美國 Thermo Fisher Scientific 公司;cDNA 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBR Green 染料法熒光定量 PCR 技術(shù)檢測試劑盒購自寶生物工程(大連)有限公司;PELP1引物(上游5′-CGG ACC AAG GTG TAT GCG ATA TT-3′,下游5′-CCA GTC TGC AAA CTC CCA TCA G-3′)、SETDB1引物(上游5′-GAA TCT TCC CGG CCT ACA GAA AT-3′,下游5′-AGA TCC TGG GAA CTG CTC TTC TT-3′)均由北京擎科生物科技有限公司合成;兔抗人SETDB1多克隆抗體、兔抗人PELP1單克隆抗體均購自英國Abcam公司;即用型SABC-POD(兔IgG)免疫組織化學(xué)試劑盒購自武漢博士德生物技術(shù)有限公司。

1.2.2細(xì)胞培養(yǎng)

將卵巢癌細(xì)胞A2780(購自上海中喬新舟生物科技有限公司)、OVCAR3(購自武漢普諾賽生命科技有限公司)、SKOV3(購自武漢普諾賽生命科技有限公司)加入含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基中,正常卵巢上皮細(xì)胞IOSE80(購自上海中喬新舟生物科技有限公司)加入含10%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基中,置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng),胰蛋白酶消化傳代,取對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞提取RNA。

1.2.3實(shí)時(shí)熒光定量逆轉(zhuǎn)錄PCR

按TRIzol試劑說明書采用苯酚-氯仿抽提法提取細(xì)胞總RNA。按逆轉(zhuǎn)錄PCR試劑說明書首先配制20 μL逆轉(zhuǎn)錄PCR體系,37 ℃孵育15 min,85 ℃ 5 s終止反應(yīng)合成cDNA。取 4 μL cDNA 為模板,配制 20 μL實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)體系,使用PCR 擴(kuò)增儀按預(yù)變性 95 ℃ 30 s,變性95 ℃ 5 s,退火延伸 60 ℃ 30 s,擴(kuò)增 40 個(gè)循環(huán)的條件進(jìn)行反應(yīng)。以GADPH為內(nèi)部參照物,SETDB1和PELP1 mRNA的相對(duì)表達(dá)水平通過 2-ΔΔCt法計(jì)算得到。

1.2.4免疫組織化學(xué)

石蠟組織切片經(jīng)脫蠟、水化后進(jìn)行抗原熱修復(fù),過氧化氫抑制內(nèi)源性過氧化物酶活性后以牛血清封閉。以1 × PBS溶液配制1∶400兔抗人PELP1抗體工作液、1∶400兔抗人SETDB1抗體工作液,充分覆蓋組織切片。4 ℃ 孵育過夜。滴加生物素標(biāo)記山羊抗兔IgG,37 ℃孵育30 min后滴加SABC。使用二氨基聯(lián)苯胺顯色,蘇木素復(fù)染。結(jié)果判定根據(jù)陽性細(xì)胞所占比例及染色強(qiáng)度綜合評(píng)分:(1)陽性細(xì)胞所占比例評(píng)分:<10% 記0分,10%～<26%記1分,26%～<51%記2分,51%～<76%記3分,≥76%記4分;(2)染色強(qiáng)度評(píng)分:無著色記0分,淺黃色記1分,棕黃色記2分,棕褐色記3分。陽性細(xì)胞所占比例評(píng)分與染色強(qiáng)度評(píng)分相乘即為綜合評(píng)分,綜合評(píng)分 0分為陰性(-),1～4分為弱陽性(+),5～8分為中度陽性(++),9～12分為強(qiáng)陽性(+++);以(-)～(+)判定為陰性表達(dá),(++)～(+++)判定為陽性表達(dá)。

1.2.5觀察指標(biāo)

(1)PELP1、SETDB1 mRNA在卵巢癌細(xì)胞及正常卵巢上皮細(xì)胞中的相對(duì)表達(dá)水平;(2)PELP1、SETDB1蛋白在不同卵巢組織中的陽性表達(dá)率。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 PELP1、SETDB1 mRNA的表達(dá)情況

PELP1 mRNA在卵巢癌細(xì)胞系A(chǔ)2780、OVCAR3、SKOV3中的表達(dá)水平分別為15.967±1.140、10.266±0.776、4.168±0.200,均高于正常卵巢細(xì)胞系IOSE80(1.004±0.090),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。SETDB1 mRNA在卵巢癌細(xì)胞系A(chǔ)2780、OVCAR3、SKOV3中的表達(dá)水平分別為 1.720±0.071、2.232±0.271、4.157±0.016,均高于正常卵巢細(xì)胞系IOSE80(1.005±0.093),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),見圖1。

A:PELP1 mRNA相對(duì)表達(dá)情況;B:SETDB1 mRNA相對(duì)表達(dá)情況;a:P<0.05。

2.2 PELP1、SETDB1蛋白的表達(dá)情況

卵巢癌及正常卵巢組織大體標(biāo)本見圖2。PELP1蛋白主要表達(dá)于細(xì)胞核中,其在卵巢癌組織中呈棕黃色至棕褐色陽性表達(dá),在正常卵巢組織中呈淡黃色弱陽性或不著色陰性表達(dá)。SETDB1蛋白的表達(dá)則位于細(xì)胞質(zhì),其在卵巢癌組織中呈淡黃色弱陽性或不著色陰性表達(dá),與正常卵巢組織無差異,見圖3。卵巢癌組織中PELP1蛋白陽性表達(dá)率高于正常卵巢組織,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);二者SETDB1蛋白陽性表達(dá)率比較,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),見表1。

表1 卵巢癌組織與正常卵巢組織中PELP1、SETDB1蛋白表達(dá)情況比較[n(%)]

A:正常卵巢組織;B:卵巢癌組織。

A:正常卵巢組織中PELP1蛋白表達(dá)情況;B:卵巢癌組織中PELP1蛋白表達(dá)情況;C:正常卵巢組織中SETDB1蛋白表達(dá)情況;D:卵巢癌組織中SETDB1蛋白表達(dá)情況。

2.3 PELP1、SETDB1蛋白表達(dá)與臨床病理特征間的關(guān)系

基于卵巢癌的高發(fā)病年齡多集中在50歲以上,根據(jù)患者年齡是否>50歲將其分為兩組,分析卵巢癌組織中PELP1、SETDB1蛋白表達(dá)情況與相應(yīng)患者臨床病理資料之間的相關(guān)性。結(jié)果表明,不同F(xiàn)IGO分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況的PELP1蛋白陽性表達(dá)比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),見表2。

表2 PELP1、SETDB1蛋白表達(dá)與卵巢癌患者臨床病理特征的關(guān)系[n(%)]

3 討 論

隨著對(duì)卵巢癌認(rèn)識(shí)和研究的不斷深入、診療水平的不斷提升,卵巢癌患者的預(yù)后逐漸得到改善,但其病死率仍常年居于婦科腫瘤首位[20]。近年來,靶向治療成為有效降低卵巢癌復(fù)發(fā)率、提高患者生存率的治療措施[21]。目前,靶向藥物主要包括抗血管生成藥物、聚腺苷二磷酸核糖聚合酶抑制劑及免疫檢查點(diǎn)抑制劑等,但其獲益人群相對(duì)有限,也存在耐藥、骨髓抑制等問題,仍需繼續(xù)尋找新的分子靶點(diǎn)[5-6]。

近年來,表觀遺傳調(diào)控在癌癥發(fā)生、發(fā)展中的作用得到了廣泛研究。PELP1是一種支架蛋白及多種轉(zhuǎn)錄因子、核受體的共調(diào)節(jié)劑,通過其N-末端包含的LXXLL基序或C-末端富含谷氨酸的區(qū)域與多種轉(zhuǎn)錄因子及核受體的相應(yīng)結(jié)構(gòu)域發(fā)生相互作用,進(jìn)而發(fā)揮其生物學(xué)效應(yīng)[9]。PELP1基因定位于17p13.2,編碼長度為1 130個(gè)氨基酸組成的蛋白,表達(dá)于人腦、睪丸、卵巢及子宮等部位[22-23]。研究表明,PELP1是激素依賴性腫瘤如乳腺癌、卵巢癌、子宮內(nèi)膜癌的原癌基因,此外,在激素非依賴性腫瘤如腦腫瘤、肺癌和結(jié)直腸癌中亦有作用[24-25]。目前,PELP1在卵巢癌中的臨床價(jià)值尚不清楚,本研究表明,相較于正常卵巢組織,卵巢癌組織中PELP1蛋白的表達(dá)水平明顯升高,此外PELP1 mRNA在幾種卵巢癌細(xì)胞中的表達(dá)也明顯高于正常卵巢細(xì)胞。分析其與患者臨床病理特征的聯(lián)系,發(fā)現(xiàn)不同F(xiàn)IGO分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況的PELP1蛋白陽性表達(dá)比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。因此推測PELP1可能是一種重要的促癌蛋白,在卵巢癌的侵襲轉(zhuǎn)移過程中起到一定的促進(jìn)作用。

組蛋白甲基化是常見的表觀遺傳修飾之一,此過程可由甲基轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)。SETDB1由1 291個(gè)氨基酸組成,其編碼基因位于1q21.3,長度為50 000 bp[14],表達(dá)于人的睪丸、卵巢、闌尾及腦組織等部位。SETDB1可催化組蛋白H3上的賴氨酸9殘基發(fā)生二甲基化或三甲基化,加重染色質(zhì)的致密程度,DNA纏繞于組蛋白上組成染色質(zhì),其致密程度加重后使得該部位的DNA轉(zhuǎn)錄過程變得更難,進(jìn)而影響基因的表達(dá)[14]。研究表明,SETDB1參與了多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展[26]。由于SETDB1引起原癌基因或抑癌基因沉默或轉(zhuǎn)錄抑制的不確定性,使得其在某些組織中表現(xiàn)為腫瘤抑制作用,在另外一些組織中表現(xiàn)為腫瘤促進(jìn)作用。

LIU等[19]關(guān)于乳腺癌激素治療耐藥性形成的一項(xiàng)研究中證實(shí)了PELP1對(duì)SETDB1介導(dǎo)的蛋白激酶B(Akt)激活至關(guān)重要,但PELP1是否能夠調(diào)節(jié)SETDB1介導(dǎo)的其他生物學(xué)功能,如表觀遺傳修飾、p53信號(hào)通路傳導(dǎo)、細(xì)胞周期調(diào)控、上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化及腫瘤轉(zhuǎn)移等,仍有待進(jìn)一步研究。王巍等[16]、董紅玲[17]的研究結(jié)果表明,SETDB1在卵巢癌組織及卵巢癌細(xì)胞中均呈高表達(dá),并能促進(jìn)卵巢癌細(xì)胞的增殖、侵襲和遷移,與患者的不良預(yù)后密切相關(guān)。本研究與上述兩位學(xué)者的研究結(jié)果有所不同的是,相較于正常卵巢組織,SETDB1蛋白在卵巢癌組織中的表達(dá)并無明顯差異,但SETDB1 mRNA表達(dá)水平在幾種卵巢癌細(xì)胞系中相較于正常卵巢細(xì)胞系明顯升高,故SETDB1在卵巢癌的發(fā)生、發(fā)展過程中是否起到作用仍需深入研究。本研究表明PELP1與SETDB1 mRNA表達(dá)水平在幾種卵巢癌細(xì)胞系中均明顯升高,PELP1蛋白在卵巢癌組織中呈高表達(dá),SETDB1蛋白在卵巢癌及正常卵巢組織中的表達(dá)無明顯差異,結(jié)合文獻(xiàn)推測PELP1能參與調(diào)節(jié)SETDB1的表觀遺傳修飾功能,并可能作用于蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)錄后翻譯過程,負(fù)性調(diào)控SETDB1蛋白的表達(dá),使得原癌基因組蛋白H3K9位點(diǎn)甲基化程度減弱,染色質(zhì)的致密性程度減弱,轉(zhuǎn)錄活性增強(qiáng),進(jìn)而促進(jìn)卵巢癌的發(fā)生、發(fā)展。

目前,國內(nèi)外關(guān)于PELP1、SETDB1在卵巢癌中的研究鮮有報(bào)道,在卵巢癌中,PELP1是否能夠調(diào)節(jié)SETDB1蛋白的表達(dá)、是否參與SETDB1的表觀遺傳修飾過程,以及SETDB1介導(dǎo)的組蛋白甲基化這一表觀遺傳修飾過程在不同組織中對(duì)不同基因是否具有選擇性等問題仍需深入研究。在后期的研究中,本課題組擬擴(kuò)大樣本量,進(jìn)一步驗(yàn)證SETDB1基因在卵巢癌組織中的表達(dá)情況。預(yù)期的研究結(jié)論為,PELP1與SETDB1在卵巢癌組織及卵巢癌細(xì)胞中均高表達(dá),并可促進(jìn)卵巢癌細(xì)胞的增殖、侵襲和遷移能力,PELP1蛋白與SETDB1蛋白存在相互作用,PELP1參與調(diào)控SETDB1的表觀遺傳修飾過程,并進(jìn)一步影響基因的表達(dá)。

與基因組變異不同,組蛋白甲基化作為一種表觀遺傳調(diào)控方式,其過程是可逆的,因此,從逆轉(zhuǎn)表觀遺傳修飾的角度著手,如通過調(diào)節(jié)組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶-去甲基化酶動(dòng)態(tài)調(diào)節(jié)組蛋白甲基化過程,靶向逆轉(zhuǎn)異常的基因表達(dá),可能為卵巢癌的治療提供一種新的思路。

綜上所述,PELP1基因在卵巢癌組織及卵巢癌細(xì)胞中均呈高表達(dá),其在卵巢癌中可能發(fā)揮了重要的促癌作用。此外,PELP1可能對(duì)SETDB1有一定的調(diào)控作用,兩者有望成為卵巢癌靶向治療的新突破口。