探討姜黃素在抑制脊柱黃韌帶骨化過程中血管增生的應用價值

袁曉軍 徐文華 李廣 林軍明 甘心榮

黃韌帶骨化(ossification of ligamentum flavum, OLF)在臨床較多見, 好發于胸椎, 常壓迫脊髓致神經功能受損, 嚴重者出現癱瘓。血管生成是黃韌帶骨化的重要原因之一, 而研究發現VEGF 在誘導血管生成中起重要作用。姜黃素是從姜科姜黃屬植物根莖姜黃(turmeric)中提取的一種植物多酚, 藥性穩定且無相關毒副作用, 除了有抗炎及抗氧化效果外, 還具備一定抗腫瘤價值, 受到臨床的高度關注。近年來, 隨著臨床研究的深入, 發現基質金屬蛋白酶家族中MMP-9 是姜黃素抗血管生成的重要機制；姜黃素呈時間依賴性抑制腹水腫瘤細胞VEGF-1 和VEGF-2 基因的表達。目前對姜黃素的研究多集中于對腫瘤的研究, 但關于姜黃素對黃韌帶骨化的發生發展影響的研究較少。探討姜黃素對黃韌帶骨化中血管生成的作用研究, 有助于更好地認識黃韌帶骨化的發生原因, 為姜黃素可能成為一種臨床中具有治療黃韌帶骨化的中藥提供理論依據［1,2］。為此, 本文選取40 只脊柱黃韌帶骨化大白兔為研究對象, 對姜黃素在抑制脊柱黃韌帶骨化過程中血管增生的應用價值分析并報告如下。

1 材料與方法

1. 1 材料 選取40 只脊柱黃韌帶骨化大白兔為研究對象, 本次訂購的大白兔來自于江蘇省農科院, 雌雄不限, 大白兔平均體質量(2.44±0.15)kg, 將所有大白兔按照隨機數字表法分為對照組2、試驗組2、試驗組1、對照組1, 每組10 只。其中, 姜黃素為上海化學試劑總廠試劑三廠所產, 阿托伐他汀鈣的生產廠家為輝瑞公司, 其他試驗材料包括：Weigert 氏間苯二酚品紅染液, 隨機引物(random primer), 麗春紅S 染色液,上海華美所產的RNA 酶抑制劑 RNasin Ribonuclease Inhibitor, 上海放射免疫分析技術研究所所產的超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)放射免疫分析試劑盒, Takara 所產的EX Taq DNA 聚合酶(EX Taq DNA Polymerase), 南京聚力生物醫學工程研究所所產的丙二醛測定試劑盒, M-MLV 反轉錄酶(M-MLV Reverse Transcriptase)(promega), JEM-1010 型透射電鏡JE.OL,北京祥瑞生物制品股份有限公司所產的白細胞介素-6放射免疫試劑盒, 采用722 分光光度計。

1. 2 方法 大白兔先行模型構建, 即建立黃韌帶骨化模型：參照陳雄生等方法, 以中國大白兔為實驗對象,采用重組人骨形態發生蛋白(BMP-2)作為誘導物, 將BMP-2 明膠海綿復合載體植入黃韌帶下方間隙。試驗組1 植入含姜黃素的復合載體, 對照組1 植入含PBS的復合載體, 試驗組2 灌胃姜黃素, 對照組2 灌胃生理鹽水, 生理鹽水劑量為5 ml/d, PBS 復合載體組應用含聚丁二酸丁二醇酯干預, 使用劑量為2.0 mg/(kg·d), 在持續干預4 周后檢查四組大白兔的黃韌帶中血管增生情況。

1. 3 觀察指標 在持續干預4 周后檢查四組大白兔的黃韌帶血管增生情況, 比較四組VEGF、MMP-9、MVD、白細胞介素-6、超氧化物歧化酶、丙二醛、甘油三酯、低密度脂蛋白膽固醇、總膽固醇、高密度脂蛋白膽固醇、p53、Caspase-3 水平。再將大白兔喂養5 周后應用烏來糖實施麻醉處理, 劑量為1 g/kg, 并實施心臟穿刺抽血, 采集血液樣本后放置在試管, 于37℃環境中水浴30 min, 常規進行離心血清分離, 應用自動生化分析儀(日本)對血脂水平進行檢測, 將一部分血清放入冰箱備檢, 對超氧化物歧化酶、丙二醛、白細胞介素-6 等指標進行檢測, 對脂質降解物當中所含有的丙二醛結合硫代巴比妥酸做氧化處理后產生紅色產物, 通過硫代巴比妥酸比色法對丙二醛含量進行檢測,血清中的超氧化物歧化酶含量檢測通過放射免疫法進行, 白細胞介素-6 水平檢測采用平衡法, 常規病理及彈力纖維染色的具體步驟為：在大白兔飼養第4 周末,應用烏來糖對大白兔進行麻醉, 依次完成椎管切開, 行黃韌帶組織分離, 并對組織行VEGF［積分光密度(IOD)值］和MMP-9 檢測、組織分離、甲醛固定、脫水、浸蠟、包埋、切片、蘇木精-伊紅染色法(HE)染色、Weigert彈力纖維染色［3,4］。

1. 4 統計學方法 采用SPSS22.0 統計學軟件處理數據。計量資料以均數±標準差(±s)表示, 采用t檢驗。P＜0.05 表示差異有統計學意義。

2 結果

2. 1 四組VEGF、MMP-9、MVD 水平比較 四組VEGF、MMP-9 水平由高到低為：對照組2＞試驗組2(對照組1)＞試驗組1, 差異均具有統計學意義(P＜0.05)；試驗組2、對照組1＞試驗組1, 差異有統計學意義(P＜0.01)；試驗組2 與對照組1 比較, 差異無統計學意義(P＞0.05)。見表1。

表1 四組VEGF、MMP-9、MVD 水平比較( ±s)

表1 四組VEGF、MMP-9、MVD 水平比較( ±s)

注：與對照組2 比較, aP＜0.05；與試驗組1 比較, bP＜0.01

組別只數VEGF(pg/ml)MMP-9(μg/L)MVD(個/mm2)對照組210833.55±123.3952.45±4.7443.55±4.42試驗組210364.26±33.63ab 44.19±3.52ab 37.26±4.58ab對照組110359.14±33.47ab 43.25±3.37ab 34.14±4.52ab試驗組110 92.63±12.88a 33.76±2.37a 25.63±3.91a

2. 2 四組白細胞介素-6、超氧化物歧化酶、丙二醛水平比較 對照組2 白細胞介素-6 均高于試驗組2、對照組1 和試驗組1, 且試驗組1 均低于試驗組2 和對照組1；試驗組1 超氧化物歧化酶均高于對照組2、試驗組2 和對照組1；試驗組1 的丙二醛均低于對照組2、試驗組2 和對照組1, 且對照組2 均低于試驗組2 和對照組1, 差異具有統計學意義(P＜0.01)。見表2。

表2 四組白細胞介素-6、超氧化物歧化酶、丙二醛水平比較( ±s)

表2 四組白細胞介素-6、超氧化物歧化酶、丙二醛水平比較( ±s)

注：與對照組2 比較, aP＜0.01；與試驗組1 比較, bP＜0.01

組別只數白細胞介素-6(ng/L)超氧化物歧化酶(μg/L)丙二醛(μmol/L)對照組210827.53±59.86273.68±70.59b 6.63±1.53b試驗組210 715.41±50.81ab224.74±56.55b12.98±2.62ab對照組110 713.58±47.64ab225.28±54.17b11.75±2.54ab試驗組110 642.88±40.21a 652.63±150.432.22±0.34

2. 3 四組血脂水平比較 對照組2 甘油三酯、低密度脂蛋白膽固醇、總膽固醇水平均高于試驗組2、對照組1、試驗組1, 高密度脂蛋白膽固醇均低于試驗組2、對照組1、試驗組1, 差異具有統計學意義(P＜0.01)。見表3。

表3 四組血脂水平比較( ±s, mmol/L)

表3 四組血脂水平比較( ±s, mmol/L)

注：與對照組2 比較, aP＜0.01

組別只數甘油三酯低密度脂蛋白膽固醇總膽固醇高密度脂蛋白膽固醇對照組2101.69±0.180.57±0.051.98±0.160.68±0.05試驗組210 1.15±0.16a 0.45±0.04a 1.54±0.14a 0.81±0.07a對照組110 1.22±0.11a 0.45±0.04a 1.56±0.15a 0.80±0.08a試驗組110 0.92±0.09a 0.32±0.02a 1.06±0.09a 0.98±0.09a

2. 4 四組p53、Caspase-3 水平比較 通過電鏡檢查結果顯示試驗組1 存在明顯的平滑肌細胞凋亡, 其凋亡基因p53、Caspase-3 均高于對照組2、試驗組2 和對照組1, 差異具有統計學意義(P＜0.01)。見表4。

表4 四組p53、Caspase-3 水平比較( ±s)

表4 四組p53、Caspase-3 水平比較( ±s)

注：與試驗組1 比較, aP＜0.01

組別只數p53Caspase-3對照組2100.3941±0.2082a0.4487±0.1102a試驗組2100.4071±0.1439a0.9656±0.1183a對照組1100.4068±0.1447a0.9671±0.1159a試驗組1100.6887±0.23851.4087±0.1628

3 討論

黃韌帶骨化雖由Double 于1912 年首先發現并描述, 在東方人種發病多見, 日本報道發生率最高達34%。OLF 在頸、胸、腰椎均可發生, 但以下胸椎多見,是胸椎管狹窄癥的主要原因, 導致神經根、脊髓損傷或受壓, 出現肢體感覺異常、肌力下降等嚴重后果［5,6］。

黃韌帶骨化的典型病理變化為軟骨內化骨, 早期階段表現為纖維結構排列順序混亂, 彈性纖維程度逐漸下降, 膠原纖維產生了明顯變化(異常增生、腫脹、黏液性變樣), 隨著病情發展會演變為黃韌帶組織當中的未分化間充質產生了細胞軟骨性變化, 并導致出現纖維軟骨細胞, 軟骨逐漸進入鈣化狀態并隨著新生血管的出現, 機體當中的鈣鹽結晶體緩慢鈣化、骨化［3］。黃韌帶骨化的原因較多, 包括生物力學改變、解剖與力學因素、退變因素、炎性細胞因子等因素［4］, 以骨形態發生蛋白(BMPs)和轉化生長因子-β(TGF-β)所起作用最明顯。研究發現, 正常情況下, 韌帶當中并不存在太多的微血管, 韌帶、骨化移行區域則有大量微血管存在, 同時還有CD34+內皮組細胞, 提示血管生成在韌帶由正常向變性階段進展過程中發揮作用, 鈣化區域的肥大軟骨細胞, 在分泌生長因子的調節、刺激之下生成諸如VEGF 的血管, 新生血管會增加間質細胞濾過、基質礦化, 這都是骨化出現的重要前提, 而骨橋蛋白等是鈣化成熟的標志, 在相關研究中提出, 局部內皮細胞分泌的有利環境(缺氧、VEGF 的高表達)在損傷康復中扮演重要角色, 顯示了VEGF 促進骨生成和血管生成的效果, BMPs 發揮著不可忽視的介導價值［7,8］。

姜黃素是從姜科姜黃屬植物的根莖姜黃中提取的一種植物多酚, 目前對其作用機制的研究多集中于姜黃素對腫瘤細胞粘附及運動、基質金屬蛋白酶(MMP)、核因子-κB(NF-κB)和尿激酶型纖溶酶原激活劑(u-PA)的影響, 抑制血管的生成［9,10］。基質金屬蛋白酶家族中MMP-9 是姜黃素抗血管生成的重要機制。還有研究發現, 姜黃素抑制腹水腫瘤細胞VEGF-1 和VEGF-2基因的表達呈時間依賴性［11,12］。本次研究結果顯示,對照組2 甘油三酯、低密度脂蛋白膽固醇、總膽固醇、白細胞介素-6 均高于試驗組2、對照組1、試驗組1,高密度脂蛋白膽固醇均低于試驗組2、對照組1、試驗組1, 差異具有統計學意義(P＜0.01)。黃韌帶血管增生程度也最高。四組VEGF、MMP-9 水平由高到低為：對照組2＞試驗組2(對照組1)＞試驗組1, 差異均具有統計學意義(P＜0.05)；試驗組2、對照組1＞試驗組1,差異有統計學意義(P＜0.01)；試驗組2 與對照組1 比較,差異無統計學意義(P＞0.05)。試驗組1 超氧化物歧化酶均高于對照組2、試驗組2 和對照組1, 試驗組1 的丙二醛均低于對照組2、試驗組2 和對照組1, 且對照組2 均低于試驗組2 和對照組1, 差異具有統計學意義(P＜0.01)。通過電鏡檢查結果顯示試驗組1 存在明顯的平滑肌細胞凋亡, 其凋亡基因p53、Caspase-3 均高于對照組2、試驗組2 和對照組1, 差異具有統計學意義(P＜0.01)。

綜上所述, 姜黃素對脊柱黃韌帶骨化過程中血管增生具有抑制作用, 分析其原因可能是由于姜黃素能夠抑制VEGF、MMP-9 的表達, 抑制脊柱黃韌帶的發生發展。