敏咳方通過Wnt/β-catenin 信號通路及免疫因子動態變化對哮喘大鼠氣道上皮屏障修復作用的研究

許洋洋 王文麗

支氣管哮喘簡稱哮喘, 是一種由多種細胞和細胞成分介導的過敏性疾病, 以患者慢性氣道炎癥為特征,其中氣道重塑是哮喘最重要的病理改變之一, 其主要發病機制是氣道炎癥和免疫調節機制失衡, 其呈現漸進發展, 是導致不可逆氣流受限和持續性氣道高反應的重要因素, 也是患者出現激素抵抗的關鍵原因, 最終誘發慢性難治性哮喘。研究表明, 細胞中存在復雜的信號轉導途徑, Wnt7B/β-catenin 信號通路存在于許多組織和細胞的增殖和分化中, 通過調節各種細胞的代謝、生長、增殖、凋亡和其他生命活動, 調節炎癥介質、細胞因子和粘附因子對機體的影響, 參與哮喘氣道重塑, 對哮喘氣道炎癥和重塑具有非常重要的作用,最新研究發現, 其在哮喘的氣道炎癥和重塑中起著非常重要的作用［1-3］。近幾年, 中醫中藥治療哮喘效果顯著。基于此, 本文選取36 只無特定病原體級健康雄性SD 大鼠, 研究敏咳方通過Wnt/β-catenin 信號通路及免疫因子動態變化對哮喘大鼠氣道上皮屏障的修復作用, 研究報告如下。

1 材料與方法

1. 1 材料 選取36 只無特定病原體級健康雄性SD大鼠(遼寧長生生物有限公司提供), 隨機分為正常對照組、模型組、激素治療組、敏咳方治療組, 每組9 只。本研究獲得本院倫理委員會審核批準。

1. 2 方法 正常對照組大鼠不施加任何干預因素,自由食水, 采用0.9%氯化鈉溶液進行對比實驗。模型組大鼠采用卵清蛋白氫氧化鋁溶液致敏并激發, 將大鼠放于清潔動物房內室溫下常規飼養7 d, 自由食水, 記錄大鼠體重、呼吸、進食水量、肛溫情況, 實驗開始第1 天與第8 天腹腔注射卵清蛋白(國藥編號69003835, 原廠貨號69003835, 國藥集團)氫氧化鋁溶液(國藥編號20001060, 原廠貨號20001060, 國藥集團)1 ml(內含卵蛋白100 mg 及氫氧化鋁200 mg), 致敏大鼠, 第15 天開始, 隔日卵清蛋白生理鹽水溶液霧化14 次, 激發大鼠, 每次激發時間為20 min, 對大鼠進行風痰瘀哮喘模型建立, 取其肺常不足, 肺虛易感外風：煙熏法使大鼠感受外風, 以高脂飲食、長期激怒法致肝風內動、痰瘀互結。激素治療組大鼠在模型組基礎上加激素進行治療, 造模第16 天起開始給藥, 大鼠放入透明霧化箱中, 噴入吸入用布地奈德混懸液(商品名：普米克令舒)生理鹽水溶液, 吸入量為0.06 ml/100 g體重, 濃度為20%, 1 次/d, 共15 d。敏咳方治療組大鼠在模型組基礎上加敏咳方進行治療, 造模第16 天起開始給藥, 霧化攻擊前30 min 灌胃給藥, 非霧化日常規給藥, 連續給藥15 d。敏咳方：麻黃10 g、黃芩10 g、杏仁10 g、石膏5 g、蟬衣10 g、地龍10 g、僵蠶10 g、鉤藤10 g、白芍10 g、半夏10 g、陳皮5 g、茯苓10 g、牡丹皮10 g、赤芍10 g、黃芪10 g、白術10 g、防風10 g、甘草5 g、生地黃10 g、玄參10 g、麥冬10 g。模型組、激素治療組、敏咳方治療組每日灌胃等效劑量, 1 次/d,共15 d。正常對照組灌胃等量生理鹽水。造模30 d 各模型組大鼠繼續卵清蛋白致敏, 繼續激怒、煙熏、高脂飲食、給藥, 造模15 d。造模第45 天(遷延期), 各組隨機取2 只大鼠取材檢測指標。

1. 3 觀察指標 比較四組大鼠Wnt7B、β-catenin 及支氣管管壁厚度、支氣管平滑肌厚度、OVA-sIgE 水平。采用圖像分析技術測定大鼠支氣管管壁厚度、支氣管平滑肌厚度, ELISA 法檢測血清OVA-sIgE 水平,qRT-PCR 法測定Wnt7B、β-catenin 的表達。①支氣管壁厚度和平滑肌厚度的檢測, 選取每只大鼠3 支直徑為1～1.5 mm 的支氣管, 使用醫學圖像分析軟件(ImageproPlus)測定大鼠肺組織內支氣管總面積(Wat1)、支氣管管腔面積(Wat2)、支氣管基底膜周徑(Pbm)、平滑肌內緣內氣管面積(Wam2)和平滑肌外緣內氣管面積(Wam1), 用支氣管基底膜周徑做標準化處理, 其中支氣管壁厚度=(支氣管總面積-支氣管管腔面積)/支氣管基底膜周徑；支氣管平滑肌厚度=(平滑肌外緣內氣管面積-平滑肌內緣內氣管面積)/支氣管基底膜周徑。采用qRT-PCR 法檢測Wnt7B、β-catenin 表達,按照試劑盒(北京伊塔)說明, 將大鼠肺組織總核糖核酸(RNA)用勻漿器將組織磨碎, 加入TRIzol 處理組織。5 min 后加入氯仿, 以12000 r/min 離心5 min 后測定RNA 濃度及純度, 根據濃度取2 μg 總RNA, 按照試劑盒操作說明, 將RNA 反轉錄為互補的脫氧核糖核酸(cDNA), 取其產物以20 μl 反應體系進行PCR 擴增, 每個樣本設3 個復孔, 以95℃預變性90 s, 95℃退火5 s,58℃延伸30 s, 共40 個循環, 獲得各樣本待測基因的Ct 值后用2-ΔΔCt法進行數據處理, 計算正常對照組相對于模型組、激素治療組、敏咳方治療組的基因表達倍數變化。ELISA 法檢測血清OVA-sIgE 的表達, 按照試劑盒(上海鑫樂生物)說明書操作步驟, 利用酶標儀按照450 nm 波長測量各孔的OD 值, 按照標準曲線計算樣品OVA-sIgE。以上指標檢測在遼寧中醫藥大學病毒實驗室完成, 動物實驗于遼寧中醫藥大學實驗動物中心完成。

1. 4 統計學方法 采用SPSS22.0 統計學軟件進行數據統計分析。計量資料以均數±標準差 (±s)表示,采用t 檢驗。P＜0.05 表示差異具有統計學意義。

2 結果

2. 1 四組大鼠Wnt7B、β-catenin比較 模型組Wnt7B、β-catenin 的表達均大于正常對照組, 差異有統計學意義(P＜0.05)；激素治療組Wnt7B、β-catenin 的表達均小于模型組, 差異有統計學意義(P＜0.05)；敏咳方治療組Wnt7B、β-catenin 的表達均小于激素治療組, 差異有統計學意義(P＜0.05)。見表1。

表1 四組大鼠Wnt7B、β-catenin 比較( ±s)

表1 四組大鼠Wnt7B、β-catenin 比較( ±s)

注：與正常對照組比較, aP＜0.05；與模型組比較, bP＜0.05；與激素治療組比較, cP＜0.05

組別只數Wnt7Bβ-catenin正常對照組9 1.00±0.011.00±0.01模型組910.03±1.23a 1.95±0.27a激素治療組9 5.32±0.42b 1.42±0.18b敏咳方治療組9 4.93±1.03c 1.33±0.21c

2. 2 四組大鼠支氣管管壁厚度、支氣管平滑肌厚度及OVA-sIgE 水平比較 模型組支氣管管壁厚度、支氣管平滑肌厚度大于正常對照組, OVA-sIgE 水平高于正常對照組, 差異有統計學意義(P＜0.05)；激素治療組和敏咳方治療組支氣管管壁厚度、支氣管平滑肌厚度小于模型組, OVA-sIgE 水平低于模型組, 差異有統計學意義(P＜0.05)；敏咳方治療組支氣管管壁厚度、支氣管平滑肌厚度均小于激素治療組, OVA-sIgE 水平低于激素治療組, 差異有統計學意義(P＜0.05)。見表2。

表2 四組大鼠支氣管管壁厚度、支氣管平滑肌厚度及OVA-sIgE 水平比較( ±s)

表2 四組大鼠支氣管管壁厚度、支氣管平滑肌厚度及OVA-sIgE 水平比較( ±s)

注：與正常對照組比較, aP＜0.05；與模型組比較, bP＜0.05；與激素治療組比較, cP＜0.05

組別只數支氣管管壁厚度(μm2/μm)支氣管平滑肌厚度(μm2/μm)OVA-sIgE(ng/ml)正常對照組927.44±2.9212.58±0.9932.12±3.92模型組9 58.12±7.71a 25.38±1.56a 117.22±19.21a激素治療組9 41.51±3.39b 22.27±0.91b 67.59±7.92b敏咳方治療組9 37.12±3.21bc 20.11±0.89bc 59.51±6.39bc

3 討論

支氣管哮喘是一種涉及多種炎癥細胞和細胞因子的異質性疾病, 以氣道高反應性和氣道炎癥為主要特征的、嚴重危害公眾健康的呼吸道疾病, 其特征是慢性氣道炎癥和氣道重塑, 其臨床表現包括患者出現陣發性喘息、呼吸短促、胸悶、咳嗽等［4］。哮喘的發生與患者氣道炎癥和氣道重塑密切相關, 其中氣道炎癥的持續發作介導炎癥細胞對氣道黏膜下層的趨化性,氣道上皮的反復損傷和修復, 導致氣道成纖維細胞過度增殖和轉化, 最終導致氣道重塑, 并且氣道成纖維細胞的過度增殖也會促進纖維粘蛋白和膠原的合成, 從而損害纖毛清除和局部防御功能, 導致大量病原菌生長繁殖, 而加重氣道炎癥［5,6］。氣道滯留的黏液為細菌生長提供了良好的培養基, 容易引起呼吸道感染, 難以控制［7,8］。哮喘被認為是一種與適應性免疫應答激活有關的疾病, 其最突出的表現是Th2 細胞依賴性促進免疫球蛋白產生, 其中Wnt/β-catenin 信號通路與哮喘氣道炎癥密切相關, 并且哮喘還以先天性免疫反應為特征, 影響樹突狀細胞(DC 細胞)的轉運、先天性免疫細胞因子的產生、淋巴細胞的啟動, 其均與Wnt/β-catenin 信號轉運密切相關, Wnt/β-catenin 信號通路與哮喘氣道重塑也密切相關［9,10］。相關研究發現,β-catenin 可通過過度的支氣管拉伸β-catenin 激活,并通過細胞增殖參與哮喘的組織修復, 氣道上皮細胞分化和細胞外基質生成, 因此, β-catenin 激活是氣道重塑的關鍵機制［11］。Wnt7B 是Wnt 信號通路配體之一, 主要在肺組織上皮中表達, 在胚胎期參與肺發育,其可調節肺平滑肌細胞的發育, 其表達失衡與氣道重塑密切相關［12］。哮喘屬于中醫“哮病”的范疇, 其主要病機為“伏痰”內結, 遇感引觸, 壅阻肺氣, 肺失宣肅, 氣道攣急。課題組多年的兒科臨床及科研發現, 與普通外感疾病急性期邪實、恢復期正虛病機演變規律不同, 兒童哮喘的發病體現了虛實夾雜的病機特點。風(內風、外風)、痰瘀、虛(氣虛、陰虛)是導致哮喘反復發作、纏綿難愈的病機關鍵, 貫穿哮喘疾病發病始終。小兒為稚陰稚陽之體, 素體肺常不足, 肺虛易感外風, 哮喘患兒病初見鼻塞、咽癢、流涕、鼻癢, 為外風襲肺。采用咳敏方對大鼠進行治療, 蟬衣、地龍、僵蠶、鉤藤熄風；白芍養肝柔肝；麻黃、黃芩、杏仁、石膏為《傷寒論》名方, 治療哮喘效果顯著；半夏、陳皮、茯苓健脾化痰；黃芪、白術健脾；生地黃、玄參、麥冬滋陰；牡丹皮、赤芍清熱涼血；防風疏散風熱；甘草調和諸藥。以上藥物同用起到滋陰、清熱、健脾、息風、止喘的作用。

實驗中qRT-PCR 法測定Wnt7B、β-catenin 的表達, 結果顯示, 模型組Wnt7B、β-catenin 的表達均大于正常對照組, 差異有統計學意義(P＜0.05)；激素治療組Wnt7B、β-catenin 的表達均小于模型組,差異有統計學意義(P＜0.05)；敏咳方治療組Wnt7B、β-catenin 的表達均小于激素治療組, 差異有統計學意義(P＜0.05)。由此可見激素治療和中藥咳敏方治療均可以抑制Wnt7B、β-catenin 的表達, 但是咳敏方效果更加顯著。實驗中大鼠支氣管管壁厚度、支氣管平滑肌厚度及ELISA 法檢測血清OVA-sIgE 水平, 結果顯示, 模型組支氣管管壁厚度、支氣管平滑肌厚度大于正常對照組, OVA-sIgE 水平高于正常對照組, 差異有統計學意義(P＜0.05)；激素治療組和敏咳方治療組支氣管管壁厚度、支氣管平滑肌厚度小于模型組, OVAsIgE 水平低于模型組, 差異有統計學意義(P＜0.05)；敏咳方治療組支氣管管壁厚度、支氣管平滑肌厚度均小于激素治療組, OVA-sIgE 水平低于激素治療組, 差異有統計學意義(P＜0.05)。由此可見激素治療可以對大鼠支氣管管壁厚度、支氣管平滑肌厚度有改善作用,可降低血清OVA-sIgE 水平, 敏咳方治療組優于激素治療組。

綜上所述, 敏咳方通過Wnt/β-catenin 信號通路及免疫因子動態變化調節哮喘大鼠氣道上皮屏障修復作用, 療效顯著。