新型二維色譜系統(tǒng)建立重癥醫(yī)院獲得性肺炎患者中替加環(huán)素含量的測定方法研究

劉曉芹 李濤 董華 李文

替加環(huán)素屬于新型靜脈注射用抗生素, 抗菌效果顯著, 對重癥感染患者有良好的臨床效果, 能夠有效消除感染指征［1-3］。對于重癥醫(yī)院獲得性肺炎患者, 替加環(huán)素是重要的治療藥物, 但血藥濃度個體差異明顯, 少數(shù)患者使用后可能出現(xiàn)生命危險, 監(jiān)測血藥濃度以嚴格控制劑量十分關鍵［4］。基于此, 本次研究一種測定重癥醫(yī)院獲得性肺炎患者體內(nèi)替加環(huán)素含量的新型二維色譜系統(tǒng)方法, 旨在確保用藥安全。

1 資料與方法

1. 1 一般資料 將2020 年1 月～2022 年6 月接收的60 例重癥醫(yī)院獲得性肺炎患者視為研究對象, 醫(yī)院倫理會批準研究實施。納入標準：①參照《中國成人醫(yī)院獲得性肺炎與呼吸機相關性肺炎診斷和治療指南(2018 年版)》［5］, 診斷為重癥醫(yī)院獲得性肺炎患者；②均接受替加環(huán)素治療。排除標準：①院前感染；②合并肺癌等惡性腫瘤；③存在其他感染性疾病；④對替加環(huán)素過敏。

1. 2 方法

1. 2. 1 儀器 全自動二維液相色譜系統(tǒng)(ALK-108, 湖南德米特儀器有限公司)；第一維色譜系統(tǒng)用于樣品預分離, 第二維色譜系統(tǒng)用于樣品分離監(jiān)測, 包括高壓輸液泵、自動進樣器、四元低壓色譜泵等, 均來自湖南德米特科技有限公司；電子分析天平(FA1004, 鶴壁精中科技有限公司)；旋渦混合器(XW-80A, 上海琪特分析儀器有限公司)；離心機(MINI-15K, 杭州奧盛儀器有限公司)。

1. 2. 2 試劑 一維試劑為TGCL-1A(500 ml/瓶, 批號：20210915, 成分為甲醇、乙腈、水、磷酸氨)；二維試劑為TGCL-2B(500 ml/瓶, 批號：20211123, 成分為甲醇、乙腈、水、磷酸氫二鈉)；輔助試劑為超純水, 乙腈、甲醇(色譜純)；高氯酸(批號：7601-90-3, 成都中錦隆科技發(fā)展有限公司, 純度76%)。

1. 2. 3 色譜條件 第一維色譜系統(tǒng)中一維液相色譜柱為(SX15-1A 3.5 mm×50 mm, 5 μm), 流動相：乙腈∶甲醇∶磷酸鹽=10∶5∶9(V/V/V), pH 為5, 中間色譜柱為雙通柱, 二維色譜柱為(SCB-2A 4.6 mm×250 mm,5 μm), 流動相：乙腈∶甲醇∶磷酸氫二鈉=7∶22∶16(V/V/V)。流速設置為1 ml/min, 柱溫45℃, 檢測波長CH1: 340 nm CH2: 269 nm, 進樣體積200 μl。

1. 2. 4 溶液制備 溶液制備包括調(diào)試液、質(zhì)控品與校準品, 其中調(diào)試液為替加環(huán)素凍干調(diào)試液(5×1 ml/盒,批號：20200407)；質(zhì)控品為TGCL-1FA 質(zhì)控品(1 ml/支,批號：20211026)；校準品為TGCL-1FA 校準品(1 ml/支,批號：20211026)。

1. 2. 5 血清樣本處理 嚴密采集血清樣本0.5 ml, 將其放在EP 管中, 加入對應質(zhì)量濃度的替加環(huán)素溶液35 μl, 旋渦振蕩30 s, 再加入0.4 mol/L 高氯酸180 μl, 旋渦振蕩60 s, 以14500 r/min 的速度離心8 min, 取上清液1 ml, 進樣250 μl。

1. 3 觀察指標 觀察新型二維色譜系統(tǒng)測定替加環(huán)素的效果, 指標包括運行時間、標準曲線與線性范圍、絕對回收率、精密度與準確度、穩(wěn)定性, 并觀察臨床測定重癥醫(yī)院獲得性肺炎患者血清中替加環(huán)素的效果。

2 結果

2. 1 運行時間 在規(guī)定的色譜條件下, 替加環(huán)素的色譜峰總運行時間為10.0 min, 保留時間為6.9 min, 其中第一維工序和捕獲工序時間為3.5 min, 第二維分離時間為5.5 min, 且色譜峰在該階段沒有干擾峰和受其他因素干擾。

2. 2 標準曲線與線性范圍 用替加環(huán)素標準儲備溶液配制成濃度分別為50、550、950、1500、2500 ng/ml的含藥血清樣本, 根據(jù)上述血清樣本處理方法, 處理后實施進樣分析, 獲得色譜圖。將濃度視為自變量(X), 峰面積視為因變量(Y), 展開回歸計算, 替加環(huán)素濃度在1500～2500 ng/ml 的線性關系最好, 標準曲線為Y=aX+b(a=81.9350, b=-497.920), r=0.999。

2. 3 絕對回收率 嚴密稱取950、1500、2500 ng/ml 低、中、高質(zhì)量濃度的替加環(huán)素質(zhì)控樣品, 經(jīng)“1.2.5”項方法下處理和“1.2.3”項下色譜條件進樣, 與相應濃度的替加環(huán)素對照品工作液峰面積比較, 發(fā)現(xiàn)絕對回收率分別為94.9%、95.3%、96.2%, 符合轉(zhuǎn)移回收率要求(90%～110%)。

2. 4 精密度與準確度 配制替加環(huán)素定量下限質(zhì)量濃度50 ng/ml 血漿樣品, 嚴密稱取950、1500、2500 ng/ml低、中、高質(zhì)量濃度的替加環(huán)素質(zhì)控樣品, 經(jīng)“1.2.5”項方法下處理和“1.2.3”項下色譜條件進樣, 連續(xù)測定3 d, 每個濃度各取6 份樣本評估, 獲得替加環(huán)素的日內(nèi)與日間精密度、準確度。日間、日內(nèi)精密度均＜3%。見表1。

表1 替加環(huán)素的日內(nèi)與日間精密度、準確度(%)

2. 5 穩(wěn)定性 950、1500、2500 ng/ml 低、中、高質(zhì)量濃度的替加環(huán)素質(zhì)控樣品, 分別在室溫條件下放置0、4、8、12 h, 反復凍融2 次, 在-20℃環(huán)境下儲存0、10、20、30 d 后, 經(jīng)“1.2.5”項方法下處理和“1.2.3”項下色譜條件進樣, 測定各濃度水平數(shù)值的精密度均＜7.6%, 表明該實驗條件下的血清中的替加環(huán)素穩(wěn)定性好。

2. 6 臨床應用 用本方法測定重癥醫(yī)院獲得性肺炎患者血清中的替加環(huán)素質(zhì)量濃度, 給藥方式均為靜脈滴注, 維持劑量為50 mg 或100 mg, 在藥物濃度達到穩(wěn)定狀態(tài)12 h 后采集靜脈血, 經(jīng)“1.2.5”項方法下處理血清樣本和“1.2.3”項下色譜條件進樣分析, 顯示用藥后血藥濃度范圍在0.113～0.824 μg/ml, 滿足血清中替加環(huán)素濃度檢測標準。見表2。

表2 臨床應用分析

3 討論

醫(yī)院作為主要的診療場所, 每天接收大量患者,各種藥物與醫(yī)療器械使用頻繁, 極易出現(xiàn)院內(nèi)接觸傳播的病原菌, 如部分患者不注重手衛(wèi)生導致病原菌傳播, 加上患者自身免疫力低下, 醫(yī)院獲得性肺炎發(fā)生率高［6］。老年患者因為合并糖尿病等慢性疾病, 同時可能留置尿管、氣管插管, 是發(fā)生多重耐藥鮑曼不動桿菌肺部感染的高危人群, 替加環(huán)素是治療院內(nèi)感染的有效藥物, 效果優(yōu)于單純頭孢哌酮舒巴坦, 能夠快速減輕機體炎癥反應［7-9］。

不過隨著臨床耐藥性的提高, 合理應用替加環(huán)素具有重要意義, 且任何藥物均存在一定毒性作用, 如何在保證安全的前提下最大化增強藥物療效是臨床需重點關注的問題, 而血藥濃度是調(diào)整用藥方案的重要依據(jù), 有必要提高血藥濃度監(jiān)測精確度［10］。目前監(jiān)測血藥濃度方法有質(zhì)譜分析、高效液相色譜檢測等。馬霖等［11］在研究中發(fā)現(xiàn), 高效液相串聯(lián)質(zhì)譜系統(tǒng)同時測定人血漿中伏立康唑和替加環(huán)素的濃度效果令人滿意, 精密度控制在6.48%～14.37%, 準確度在85.20%～107.08%, 平均提取回收率超過90.50%, 穩(wěn)定性好, 不僅樣本處理簡便, 且靈敏度高, 專屬性強。但高效液相色譜存在“柱外效應”, 在進樣到檢測器之間, 若流動相的流型發(fā)生變化, 被分離物質(zhì)的任何擴散與滯留都將造成色譜峰加寬, 柱效率下降［12,13］。二維色譜是最早用于紙色譜和薄層色譜的化學分析方法,由于二維電泳在蛋白組學研究中十分活躍, 能夠檢測存在差異化的蛋白［14］。血藥濃度監(jiān)測精確度主要受干擾峰影響, 本次研究提出一種新型二維色譜血藥濃度監(jiān)測方法, 結果色譜峰未出現(xiàn)干擾峰, 950、1500、2500 ng/ml 低、中、高質(zhì)量濃度的替加環(huán)素質(zhì)控樣品絕對回收率符合轉(zhuǎn)移回收率要求(90%～110%), 日內(nèi)與日間精密度＜3%, 同時穩(wěn)定性好, 在具體臨床應用中精準測得替加環(huán)素血藥濃度, 提示該種方法具有較高的應用價值。這是因為新型二維色譜系統(tǒng)運用三根色譜柱, 分別為一維色譜柱、中間色譜柱與二維色譜柱, 依次對血樣實施富集、轉(zhuǎn)移與分離, 去掉大量雜質(zhì), 改善分離能力, 減少其他干擾, 提高精密度［15］。另外, 利用聚焦體系在規(guī)定時間內(nèi)改變流動相比例, 讓藥物呈點狀進入色譜柱, 避免體積過大進樣應藥物分散造成擴散誤差［16］。

綜上所述, 新型二維色譜系統(tǒng)是一種可靠的重癥醫(yī)院獲得性肺炎患者中替加環(huán)素含量測定方法, 操作簡便, 精密度高, 但由于替加環(huán)素血液中濃度較低, 對臨床治療效果預測作用仍需進一步研究。