LncRNA GAS5 在缺血性腦卒中的表達及臨床價值

楊挲挲 韓鵬飛 趙樂 李夢真 查江杰 程銘

缺血性腦卒中(ischemic stroke, IS)在我國是一種比較常見的心血管疾病, 該疾病的特點是發病例數多,并且患者殘疾率、復發率以及死亡率都比較高［1］, 對人們的身體和精神健康有極大的威脅。近年來靜脈溶栓在IS 治療中取得了很大進展, 但IS 患者有限的治療窗口仍然是臨床救治中的一個巨大挑戰［2］。因此早期診斷及尋找新的生物標志物對監測疾病進展和改善IS尤為重要。LncRNA 是一種調控分子, 通過轉錄和轉錄后途徑來控制靶基因的表達并且通過改變動脈粥樣硬化、炎癥、細胞存活和血管生成來參與IS 的病理過程［3］。研究顯示, 生長阻滯特異轉錄物5(growth arrestspecial transcript 5, GAS5)是多種癌癥的腫瘤抑制因子［4］。最近的研究也將LncRNA GAS5 與血管疾病聯系起來。多項證據表明LncRNA GAS5 參與了調控血管狹窄、炎癥和神經細胞凋亡［5］。然而, 大多數LncRNA GAS5 在IS 中的研究主要為其在IS 病理生理中的作用,而對其臨床價值的研究相對較少［6］。因此, 本研究旨在探討LncRNA GAS5 與IS 患者病情嚴重程度相關性及臨床應用價值, 以期從分子生物學水平上為IS 的診斷、治療提供新的方向, 報告如下。

1 資料與方法

1. 1 一般資料 選取2021 年9 月～2022 年11 月在牡丹江醫學院附屬紅旗醫院就診的90 例IS 患者作為病例組, 平均年齡(59.56±4.68)歲；其中男58 例, 女32 例。將病例組患者按照IS 嚴重程度分為輕度組、中度組、重度組, 每組30 例。另選取同期健康體檢者45 例作為健康對照組, 平均年齡(60.40±5.76)歲；其中男27 例, 女18 例。病例組和健康對照組一般資料比較,差異無統計學意義(P＞0.05), 具有可比性。在實驗開始前本研究已通過醫學倫理委員會批準, 且受試者均需在實驗正式開始前了解知情同意書內容并確認自愿參與實驗。實驗材料為受試者的新鮮血清, 且采集血清的時間不得＞6 h, 血清收集完畢后置于-80℃冰箱保存。病例組納入標準：①依據《中國急性缺血性腦卒中診治指南2022》相關內容, 患者在實驗開始前需要證明其確實患有IS, 證明材料可以是頭部CT 結果或磁共振成像(MRI)診斷；②年齡45～70 歲。健康對照組納入標準：①年齡45～70 歲；②無心腦血管疾病及其他基礎疾病。排除標準：①先天性或獲得性心血管疾病；②肝臟、腎臟等重要臟器均已出現一定的功能障礙；③患者還患有血管性腫瘤, 且該腫瘤為惡性腫瘤；④嚴重感染或自身免疫性疾病；⑤孕婦或哺乳期婦女。

1. 2 方法

1. 2. 1 主要試劑和儀器 總RNA提取試劑使用TRIpure Total RNA Extraction Reagent 試劑(ELK Biotechnology 生產)、逆轉錄試劑使用Strand cDNA Synthesis Kit(EntiLink? 1st生產)、目的基因提取試劑使用SYBR Green PCR SuperMix(EnTurbo?生產)；PCR 引物［生工生物工程(上海)股份有限公司設計］；PCR 儀(型號：基因擴增儀TC-XP)購自杭州博日科技股份有限公司；熒光定量PCR 儀( 型號：StepOne? Real-Time PCR System)購自LifeTechnologies；制冰機(型號IMS-20)購自常熟市雪科電器有限公司；三氯甲烷、異丙醇、無水乙醇均來自國藥集團化學試劑有限公司；RNase Free 水為自配。

1. 2. 2 收集血清標本 采集所有受測者外周全血5 ml于普通生化管, 靜置15 min, 靜置溫度為室溫即可, 下一步進行離心操作, 將離心時間設置為10 min, 離心速度設置為4000 r/min, 離心時提前準備好無菌無酶EP管, 用于轉移離心上清液, 于-80℃儲存。

1. 2. 3 總RNA 提取和逆轉錄 取出血清于常溫下解凍用于總RNA 提取。首先準備好1.5 ml 無菌無酶EP管, 加入血清, 血清體積為250 μl。然后依次加入1 ml TRIpure、250 μl 三氯甲烷, 每加入一項試劑后都需要將混合物搖勻, 之后靜置5 min, 混合靜置均需在冰上進行操作。混勻靜置后進行離心操作, 離心溫度為4℃,離心速度為10000 r/min, 離心時間為10 min。之后取上清液500 μl, 置于EP 管中, 并將500 μl 異丙醇加入上清液中沉淀, 異丙醇加入前要經過4℃預冷。之后將上清液和異丙醇的混合物混合均勻, 靜置15 min, 靜置溫度為-20℃。之后需要再次離心, 離心速度、溫度、時間均與第一次離心時保持一致, 將上清液轉移至新的EP 管中, 加入1 ml 75%乙醇, 加入前乙醇也要先在4℃預冷, 之后來回顛倒幾次后, 再次離心5 min, 離心溫度和速度均保持不變, 離心結束后再次將上清液倒出, 沉淀干燥幾分鐘后加入100 μl RNase Free 水, 使得到的RNA 充分溶解。提取出的RNA 經超微量分光光度計檢測其純度。使用ELK Biotechnology 逆轉錄試劑盒進行逆轉錄, 操作嚴格按照說明書。需注意的是反應液的配置應在冰上進行, 之后于PCR 儀上進行操作。

1. 2. 4 LncRNA GAS5 檢測 qRT-PCR 可以對病例組患者血清中LncRNA GAS5 表達情況進行實時檢測。內參基因可以選擇Actin。按照試劑盒說明書操作, 擴增時使用的儀器為StepOne? Real-Time PCR 儀。擴增條件：①進行預變性, 預變性溫度為95℃, 時間設置為3 min, 只進行1 個循環；②進行變性, 變性溫度設置為95℃, 變性時間為10 s；③復性, 溫度設置為58℃, 時間為30 s；④延伸, 溫度設置為72℃, 時間為30 s。第②、③、④步共設置40 個循環。預根據儀器默認設置來做熔解曲線。LncRNA GAS5 的相對表達量=2-ΔΔCT。引物為：Actin-F：5'-GTCCACCGCAAATGCTTCTA-3'；ACTIN-R ：5'-TGCTGTCACCTTCACCGTTC-3' ；LncRNA GAS5-F：5'-CTTGCTTGGGTAAGGACATG-3'；GAS5-R：5'-GTTTAGGATAACAGGTCTGCCTG-3'。

1. 3 觀察指標 比較四組血清LncRNA GAS5 表達水平, 分析病例組患者LncRNA GAS5 相對表達水平與NIHSS 評分的相關性以及microRNA-27a 對IS 的診斷效能。

1. 4 統計學方法 采用SPSS25.0 統計學軟件處理數據。計量資料以均數±標準差(±s)表示, 采用t 檢驗；計數資料以率(%)表示, 采用χ2檢驗。在利用數據繪圖時, 使用的軟件為GraphPad Prism 8。相關性分析采用Pearson 相關系數, 繪制ROC 曲線判斷LncRNA GAS5 的診斷效能。P＜0.05 表示差異有統計學意義。

2 結果

2. 1 四組血清LncRNA GAS5 表達水平比較 qRTPCR 結果表明：LncRNA GAS5 在健康對照組以及輕度組、中度組、重度組中的表達水平分別為(1.12±0.97)、(2.17±1.16)、(3.20±1.24)、(5.07±1.97), 輕度組、中度組、中度組LncRNA GAS5 表達水平高于健康對照組, 且重度組LncRNA GAS5 表達水平高于中度組和輕度組, 中度組高于輕度組, 差異均具有統計學意義(P＜0.001)。見圖1。

2. 2 病例組患者LncRNA GAS5 相對表達水平與NIHSS 評分的相關性分析 經Pearson 相關性分析表明, 病例組患者LncRNA GAS5 相對表達水平與NIHSS評分呈正相關(r=0.63, P＜0.01)。見圖2。

圖2 病例組患者LncRNA GAS5 相對表達水平與NIHSS 評分的相關性分析

2. 3 LncRNA GAS5 對IS 的診斷效能分析 通過ROC曲線分析, LncRNA GAS5 的AUC 為0.893(0.836～0.950),靈敏度為93.3%, 特異度為68.9%, 截斷值為1.18。見圖3。

圖3 LncRNA GAS5 對IS 診斷效能的ROC 曲線

3 討論

中國是腦卒中大國, 據推算, 現在心血管疾病患者高達3.3 億, 其中患腦卒中為1300 萬人。全球疾病負擔研究(GBD)研究還顯示, 2019 年腦卒中是中國第一大死因［7］。IS 是腦卒中最常見的類型, 血壓血脂過高、糖尿病、吸煙等都有可能引發腦卒中［8］。缺血引起的損傷和神經元細胞的死亡, 可能還會導致殘疾,給個人和社會造成了沉重負擔［9］。因此, 發掘新的、安全無創、高效準確的生物標志物對于早期預防并診斷IS 尤為重要。

LncRNA GAS5 被首次發現在受生長抑制的小白鼠NIH3T3 纖維化細胞中過表達［10］。隨后, 科研人員們對LncRNA GAS5 進行了深入的研究。發現LncRNA GAS5 位于1q25.1 號染色體上, 是由630 個核苷酸構成的［11］。研究結果證明, LncRNA GAS5 是一種對細胞增殖和凋亡有重要調控作用的LncRNA, 在人體組織中廣泛表達。目前已經有研究證實, LncRNA GAS5 在許多腫瘤中都呈現出低表達狀態, 且它表達量的高低影響著腫瘤的發生發展情況［12］。近年來隨著研究者的深入發現表明, LncRNA GAS5 在心腦血管疾病、內分泌代謝性疾病以及自身免疫性疾病等非腫瘤性疾病中也發揮重要作用［13］。

有報道顯示, LncRNA GAS5 在IS 患者的斑塊中表達顯著高于正常人［14］。而IS 的病理生理學基礎之一就是動脈粥樣硬化, 所以認為LncRNA GAS5 表達與IS存在一定的關系。然而, 關于LncRNA GAS5 與IS 的研究較少, 且大多為動物和細胞模型實驗。比如, Shen等［15］發現干擾LncRNA GAS5 的表達能通過 miR-34b-3p/EPHA4 軸減輕腦微血管內皮細胞中氧-葡萄糖剝奪/再灌注(OGD/R)誘導的損傷。Wang 等［16］發現在腦卒中大鼠模型中, LncRNA GAS5 下調可以通過miR-9/FOXO3 軸來減輕神經元細胞損傷。此外, Jiang等［17］研究表明干擾LncRNA GAS5 的表達可以通過miR-4/STAT1192A 軸抑制AQP5 進而阻斷實驗性腦缺血再灌注損傷。

因此本研究收集了IS 患者與健康體檢者血清進行分析。采用qRT-PCR 技術檢測LncRNA GAS5 在血清中的表達情況, 發現病例組各小組LncRNA GAS5 表達水平高于健康對照組, 且重度組LncRNA GAS5 表達水平高于中度組和輕度組, 中度組高于輕度組, 差異均具有統計學意義(P＜0.001)。此外, 為了進一步分析, 本文還采用Pearson 相關性分析對LncRNA GAS5 相對表達水平與NIHSS 評分進行分析, 運用ROC 曲線分析了LncRNA GAS5 表達對IS 的診斷價值。結果顯示：病例組患者LncRNA GAS5 相對表達水平與NIHSS 評分呈正相關(r=0.63, P＜0.01)。LncRNA GAS5 的AUC 為0.893(0.836～0.950), 靈敏度為93.3%, 特異度為68.9%,截斷值為1.18。LncRNA GAS5 對IS 診斷有較好的預測價值。這些數據表明, LncRNA GAS5 可能是一種有利于IS 風險診斷的新型生物標志物。

這項實驗仍然有一些不足之處, 比如實驗樣本數量比較少, LnRNA GAS5 表達水平可能存在一定偏倚,日后需加大樣本量進行研究；尚未運用Logistic 回歸分析對IS 的危險因素進行研究；尚未對LnRNA GAS5表達對于IS 預后的評估價值進行深入探討。研究應將IS 的危險因素以及預后臨床資料納入研究范圍, 以更加明確LnRNA GAS5 在IS 中的臨床應用價值。

綜上所述, IS 患者與健康體檢者取新鮮血清檢測后發現, LncRNA GAS5 表達在IS 患者血清中出現明顯升高, 且患者病情越嚴重表達水平越高, 因此可以將LncRNA GAS5 表達水平作為IS 的輔助生物診斷指標。