DNA 甲基化與精神分裂癥的研究進(jìn)展

尹文卅 ，盧玉梅 ，佟金蓮 ，聶勝潔 ，阮 冶

（1）云南省精神病醫(yī)院醫(yī)務(wù)部;2）云南省精神衛(wèi)生防治中心;3）昆明醫(yī)科大學(xué)附屬精神衛(wèi)生中心，云南 昆明 650224;4）昆明醫(yī)科大學(xué)法醫(yī)學(xué)院，云南 昆明 650500;5）昆明醫(yī)科大學(xué)研究生院，云南 昆明 650500）

據(jù)統(tǒng)計(jì)，全球大約有2 300 萬人患有精神分裂癥（schizophrenia，SCZ），與普通人群相比SCZ 患者的預(yù)期壽命減少了15～20 a[1-2]。SCZ 確切的遺傳模式不清，發(fā)病機(jī)制尚未明。近年來的研究發(fā)現(xiàn)SCZ 是一種遺傳異質(zhì)性疾病，由遺傳學(xué)，表觀遺傳學(xué)，神經(jīng)生物學(xué)和環(huán)境因素等多種因素共同作用而形成[3]。通過全基因組關(guān)聯(lián)研究（genome-wide association studies，GWAS）以及單核苷酸多態(tài)性（single nucleotide polymorphism，SNP）等研究發(fā)現(xiàn)，SCZ 的發(fā)病機(jī)制與環(huán)境、遺傳以及表觀遺傳調(diào)控（尤其是DNA 甲基化）改變基因表達(dá)有關(guān)[4-6]。

盡管SCZ 的研究逐漸增加，但目前尚未發(fā)現(xiàn)明確的病理生理機(jī)制、分子診斷或精確的生物學(xué)標(biāo)志物。DNA 甲基化有望更好地理解SCZ 病理生理學(xué)機(jī)制，并有希望獲得精確的生物學(xué)標(biāo)志物。基于此，現(xiàn)對(duì)SCZ 中不同基因DNA 甲基化研究進(jìn)行綜述如下。

1 DNA 甲基化

DNA 甲基化是指在DNA 甲基轉(zhuǎn)移酶的催化下，將S-腺苷甲硫氨酸的一個(gè)甲基基團(tuán)轉(zhuǎn)移到DNA 分子堿基上。甲基化部位主要發(fā)生在CpG 島的基因組中富含胞嘧啶和鳥嘌呤的片段[7]，通常在胞嘧啶殘基的第5 個(gè)碳上，形成5-甲基胞嘧啶[6]。該過程由一系列DNA 甲基轉(zhuǎn)移酶（DNA methyltransferase，DNMT）催化和維持，包 括DNMT1，DNMT3A 和DNMT3B 等多種DNA 甲基轉(zhuǎn)移酶。由胞嘧啶環(huán)第5 位碳原子的共價(jià)甲基化，生成5-甲基胞嘧啶（5-methylcytosine，5mC）[8-9]。由于CpG 島通常分布在基因的啟動(dòng)子區(qū)域，經(jīng)常出現(xiàn)在轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)周圍，所以啟動(dòng)子區(qū)DNA 甲基化對(duì)調(diào)控基因的轉(zhuǎn)錄具有重要作用，通常與基因轉(zhuǎn)錄活性的降低有關(guān)。

2 DNA 甲基化測序

精神分裂癥是一種復(fù)雜的疾病，在DNA 甲基化方面涉及諸多基因。也有多種方法可以進(jìn)行DNA 甲基化的測序。例如：

Tet-酶輔助亞硫酸氫鹽測序（tet-assisted bisulfite sequencing，TAB-seq）是 一種結(jié)合Tet 酶和亞硫酸鹽測序的方法。Tet 酶可以將5-甲基脫氧胞苷（5mC）轉(zhuǎn)化為5-羥甲基脫氧胞苷（5hmC），而亞硫酸鹽測序可以區(qū)分5mC 和5hmC。通過二者結(jié)合，TAB-seq 可以提供更詳細(xì)的DNA 甲基化信息，包括5mC 和5hmC 的定位和相對(duì)豐度，在研究精神疾病DNA 甲基化動(dòng)態(tài)變化和表觀遺傳學(xué)調(diào)控方面具有重要意義[10]。

APOBEC-偶聯(lián)表觀遺傳測序（APOBECcoupled epigenetic sequencing，ACE-seq）是APOBEC 酶催化胞嘧啶脫氨基為尿嘧啶，其特異性地發(fā)生在甲基化的胞嘧啶殘基上，導(dǎo)致5-甲基胞嘧啶（5mC）轉(zhuǎn)化為胸腺嘧啶（T）。通過文庫制備后進(jìn)行高通量測序，對(duì)測序數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，以確定胞嘧啶脫氨事件的位置和模式，并將測序數(shù)據(jù)與參考基因組進(jìn)行比較，從而確定胞嘧啶脫氨發(fā)生的具體位點(diǎn)。ACE-seq 可以幫助揭示胞嘧啶脫氨在DNA 損傷和修復(fù)過程中的作用，研究發(fā)育過程中的DNA 甲基化動(dòng)力學(xué)、疾病進(jìn)展以及對(duì)環(huán)境刺激的反應(yīng)等[10]。

氧化亞硫酸氫測序（oxidative bisulfite sequencing，oxBS-seq）是一種基于氧化亞硫酸鹽的測序方法。亞硫酸氫鹽測序（BS-seq）是用單堿基分辨率量化DNA 甲基化的金標(biāo)準(zhǔn)，不同于傳統(tǒng)的BS-seq，oxBs-seq 在亞硫酸鹽處理之前會(huì)進(jìn)行氧化處理，將5hmC 轉(zhuǎn)化為5-羥甲基脫氧胞苷酸（5fC）和5-羧甲基脫氧胞苷酸（5caC），通過測序技術(shù)區(qū)分5mC、5hmC、5fC 和5caC，從而提供更全面的DNA 甲基化信息[11]。

納米孔技術(shù)測序（nanopore technologies sequencing）下是第三代（長讀）測序方法，可以讀取較長的DNA 片段，與Illumina 常用的“合成測序”方法相比，納米孔技術(shù)的測序是基于電流的微小變化[12]。在測序過程中，DNA 鏈穿過嵌入在聚合物膜上直徑約1.8 nm 的蛋白質(zhì)納米孔，當(dāng)DNA 鏈進(jìn)入孔內(nèi)時(shí)，電流根據(jù)孔內(nèi)的DNA 堿基而變化，從而使得檢測表觀遺傳變化成為可能[12]。其優(yōu)點(diǎn)在于它具有高通量、實(shí)時(shí)性和單分子級(jí)別的分辨率，能提供全基因組信息，長讀取允許檢測罕見變異、缺失、插入、重復(fù)區(qū)域以及DNA 甲基化等[12-13]。對(duì)于研究精神疾病DNA 甲基化的動(dòng)態(tài)變化和空間分布具有重要意義，其缺點(diǎn)是樣品檢測價(jià)格較為昂貴。

3 DNA 甲基化與SCZ

在SCZ 的發(fā)生和發(fā)展過程中，DNA 的甲基化是最早發(fā)現(xiàn)與SCZ 相關(guān)的表觀遺傳修飾之一。同時(shí)，DNA 甲基化是表觀遺傳學(xué)研究最為廣泛的表觀遺傳學(xué)修飾類型。從GWAS 分析結(jié)果來看，SCZ 可能是不同基因甲基化變化的共同作用的結(jié)果[14-15]。多項(xiàng)研究表明，在SCZ 中發(fā)現(xiàn)了多個(gè)基因的甲基化異常。諸如，SCZ 存在RELN、HTR2A、SOX10等基因啟動(dòng)子DNA 甲基化異常。此外，還有研究發(fā)現(xiàn)SCZ 患者大腦皮質(zhì)灰質(zhì)和白質(zhì)的DNA 甲基化差異顯著[16]。Chen 等[17]進(jìn)行的一項(xiàng)研究確定了血細(xì)胞中SCZ 特異性DNA 甲基化特征，并且這些特征（如背外側(cè)前額葉皮層的甲基化差異）在尸檢樣本中仍可以觀察到。從神經(jīng)遞質(zhì)通路來看，SCZ 中DNA 甲基化涉及5-羥色胺、多巴胺、谷氨酸、γ-氨基丁酸等多種神經(jīng)遞質(zhì)通路。多巴胺（Dopamine，DA）、5-羥色胺（Serotonin，5-HT）、去甲腎上腺素（Noradrenaline，NA）和腦源 性神經(jīng) 營養(yǎng)因 子（Brain-derived Neurotrophic Factor，BDNF）等多個(gè)基因甲基化與SCZ 明顯相關(guān)[18-19]。從神經(jīng)分化與發(fā)育看，Lisoway 等人關(guān)于SCZ 的研究發(fā)現(xiàn)SCZ 患者DNA甲基化與神經(jīng)分化和發(fā)育相關(guān)基因富集方面存在顯著差異[5]。早期大腦發(fā)育過程中的DNA 甲基化也與SCZ 風(fēng)險(xiǎn)有關(guān)，DNA 甲基化容易受到藥理作用等環(huán)境因素的影響，可作為尋找治療SCZ 更有效的治療新靶點(diǎn)[20]。最近，在應(yīng)用甲基化DNA免疫沉淀芯片研究SCZ 患者外周血單核細(xì)胞基因組DNA 甲基化失調(diào)中發(fā)現(xiàn)：SHANK3啟動(dòng)子高甲基化，且其高甲基化與左側(cè)下葉皮質(zhì)表面區(qū)域呈負(fù)相關(guān)，與首發(fā)SCZ 中陰性癥狀分?jǐn)?shù)呈正相關(guān)。轉(zhuǎn)錄因子YBX1 進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)在誘導(dǎo)多能干細(xì)胞衍生的皮質(zhì)中間神經(jīng)元（cINs）而不是谷氨酸能神經(jīng)元中與SHANK3啟動(dòng)子的高甲基化區(qū)結(jié)合；使用shRNAs 在cINs 中證實(shí) 了YBX1 對(duì)SHANK3 表 達(dá)的直接正向調(diào)節(jié)作用[21]。

總之，在SCZ 中，有來自不同組織的多個(gè)候選基因研究表明，不同的候選基因在SCZ 的病例對(duì)照研究中存在DNA 甲基化的差異。

4 SCZ 與不同基因DNA 甲基化

4.1 MAOA 基因

在人類中，MAOA 基因位于X 染色體（Xp11.3）上與MAOB 相鄰的位置。這兩個(gè)基因具有相似的外顯子-內(nèi)含子組成，共有16 個(gè)外顯子，序列一致性約為70%。在體內(nèi)體外實(shí)驗(yàn)中，MAOA 啟動(dòng)子甲基化與MAOA 表達(dá)呈負(fù)相關(guān)。甲基化機(jī)制還負(fù)責(zé)調(diào)節(jié)新發(fā)現(xiàn)的MAOA 相關(guān)的lncRNA，該lncRNA 抑制了大腦中的MAOA 表達(dá)[22]。此外，MAOA 基因的甲基化水平與反社會(huì)行為，暴力行為，Brunner 綜合征以及SCZ 等多種行為和疾病有關(guān)。在偏執(zhí)型SCZ 中，與健康男性對(duì)照相比SCZ 男性患者中MAOA 啟動(dòng)子CpG 位點(diǎn)甲基化增加也已被證實(shí)。與之類似地，學(xué)者池野田等研究團(tuán)隊(duì)通過焦磷酸測序技術(shù)，對(duì)5-羥色胺轉(zhuǎn)運(yùn)體基因（SLC6A4）DNA 甲基化進(jìn)行研究，同樣發(fā)現(xiàn)類似的性別差異，在男性SCZ 患者中SLC6A4的CpG位點(diǎn)顯著超甲基化[23]。此外，Yang 等[18]也表明MAOA 甲基化水平在SCZ 患者中顯著升高，并且男性和女性患者的MAOA 甲基化水平與精神分裂癥呈現(xiàn)正相關(guān)。

4.1.1 COMT 基因COMT基因位于22q11.2 染色體的片段中，敲除該基因會(huì)導(dǎo)致復(fù)雜的綜合征，其精神表現(xiàn)包括SCZ 以及其他的精神障礙。COMT基因編碼2 種特征顯著的蛋白質(zhì)亞型，細(xì)胞質(zhì)中可溶性的COMT（Soluble cytoplasmic COMT，S-COMT）以及膜結(jié)合形式的COMT（membranebound COMT，MB-COMT）。MB-COMT 對(duì)多巴胺和去甲腎上腺素的親和力大約是S-COMT 的10 倍，這表明MB-COMT 更適合在大腦的生理水平上代謝包括多巴胺在內(nèi)的兒茶酚胺。在SCZ 中，COMT 酶參與多巴胺等兒茶酚胺的降解過程。有證據(jù)表明，在SCZ 患者中，COMT啟動(dòng)子區(qū)域甲基化增加，并且可以作為男性SCZ 患者外周生物標(biāo)志物用于預(yù)測男性的SCZ 風(fēng)險(xiǎn)[24]。此外，SCZ的潛在風(fēng)險(xiǎn)被認(rèn)為與COMT基因的甲基化程度降低有關(guān)[24-26]，COMT甲基化增加被認(rèn)為會(huì)導(dǎo)致COMT基因表達(dá)降低[27]。人們認(rèn)為，SCZ 患者的COMT 甲基化程度降低導(dǎo)致COMT 蛋白的表達(dá)增加，從而使其活性增加。COMT 活性增加后導(dǎo)致神經(jīng)遞質(zhì)釋放后突觸DA 水平下降，這最終降低了突觸后神經(jīng)元的多巴胺能刺激，當(dāng)這種情況發(fā)生在前額區(qū)時(shí)，可能導(dǎo)致SCZ 患者出現(xiàn)常見的執(zhí)行功能下降。

4.1.2 GAD1 基因谷氨酸脫羧酶1 基因（GAD1）編碼編碼谷氨酸脫羧酶，在人體中該酶負(fù)責(zé)催化L-谷氨酸產(chǎn)生γ-氨基丁酸。GABA 是一種主要的抑制性神經(jīng)元遞質(zhì)，其抑制作用由GABAA 和GABAB 兩種受體介導(dǎo)，在神經(jīng)發(fā)育障礙中起關(guān)鍵作用，與癲癇、精神分裂癥、雙相情感障礙等多種神經(jīng)精神疾病有關(guān)[28]。國內(nèi)有研究發(fā)現(xiàn)，SCZ患者啟動(dòng)子DNA 甲基化（5mC）和羥甲基化（5hmC）比值與單核苷酸多態(tài)性（SNPs）基因型顯著相關(guān)，揭示了SCZ 患者GABRB2 基因型依賴性甲基化和羥甲基化的改變[29-30]。此外，GAD1基因啟動(dòng)子高甲基化與SCZ 患者基因型和蛋白表達(dá)不足有關(guān)，前扣帶回皮質(zhì)的脂肪酸結(jié)合蛋白3（Fatty acid-binding proteins，F(xiàn)ABP3）調(diào)節(jié)谷氨酸脫羧酶（GAD1）啟動(dòng)子區(qū)的甲基化狀態(tài)[31]。有研究表明，GABA 能基因如GAD1的下調(diào)是通過額葉皮層和其他腦區(qū)的高甲基化介導(dǎo)的，且這種高甲基化發(fā)生在基因的啟動(dòng)子區(qū)域[32]。GAD1基因的表達(dá)改變被認(rèn)為會(huì)導(dǎo)致工作記憶功能受損和皮質(zhì)活動(dòng)紊亂，這在SCZ 患者中很明顯[33]。以上證據(jù)表明SCZ 患者存在GAD1基因的啟動(dòng)子區(qū)域甲基化失調(diào)。

4.2 BDNF 基因

腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子（brain-derived neurotrophic factor，BDNF）是一種調(diào)節(jié)突觸傳遞和可塑性的神經(jīng)營養(yǎng)因子，在神經(jīng)元細(xì)胞的增殖、分化、成熟和存活中發(fā)揮作用。在大腦中，BDNF 是腦區(qū)神經(jīng)可塑性的關(guān)鍵中介，與早期生活事件和精神疾病都有關(guān)聯(lián)。有研究認(rèn)為BDNF基因甲基化變化可能是早期生活逆境的一個(gè)生物標(biāo)志物，因此也可能是成人精神疾病的一個(gè)生物標(biāo)志物[34]。在SCZ 中，BDNF基因被認(rèn)為是SCZ 發(fā)病機(jī)制的候選基因，與SCZ 的認(rèn)知癥狀有關(guān)[35]，BDNF啟動(dòng)子的CpG 位點(diǎn)DNA 甲基化與SCZ 認(rèn)知功能修復(fù)有關(guān)[36]。此外，有研究表明，BDNF基因rs6265 甲基化與基因型相互作用，與SCZ 相關(guān)[37]。此前也有研究發(fā)現(xiàn)，SCZ 患者前額葉皮層和紋狀體BDNF 基因的DNA 甲基化狀態(tài)沒有改變[38]。導(dǎo)致研究結(jié)果不一致，可能是由于影響DNA 甲基化的共同因素所導(dǎo)致，如發(fā)病年齡、性別和藥物濫用等[36]。

4.3 RELN 基因

RELN基因被認(rèn)為與SCZ 有關(guān)[39-41]。RELN基因編碼一種細(xì)胞外基質(zhì)蛋白，該蛋白在大腦發(fā)育過程中參與細(xì)胞定位和神經(jīng)元遷移[42]。RELN基因的甲基化被認(rèn)為是調(diào)節(jié)RELN表達(dá)的重要因素，被認(rèn)為與精神疾病有關(guān)。SCZ 相關(guān)的藥物以及動(dòng)物模型也能證實(shí)DNA 甲基轉(zhuǎn)移酶I（DNMT1）導(dǎo)致谷氨酸脫羧酶67（GAD67）、細(xì)胞外基質(zhì)蛋白（RELN）和腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子（BDNF）等基因高甲基化，導(dǎo)致基因表達(dá)減少，并觀察到類似的行為內(nèi)表型[43-44]。此外，還發(fā)現(xiàn)SCZ 患者大腦中RELN基因表達(dá)減少還可能是SCZ 患者認(rèn)知功能異常的基礎(chǔ)[45]，通過認(rèn)知修復(fù)也可以可逆性的改變RELN啟動(dòng)子CpG 甲基化水平，從而改變額葉以及額葉與顳葉的功能連接[36]。近期的研究還發(fā)現(xiàn)SCZ 的不同階段，患者RELN基因的DNA 甲基水平不同，首次發(fā)作的SCZ 和慢性SCZ 的隊(duì)列研究中RELN 啟動(dòng)子區(qū)域DNA 甲基化水平可能作為癥狀嚴(yán)重程度的生物標(biāo)記物基因之一[46]。

4.4 其他基因

此外，還可有研究發(fā)現(xiàn)膽堿能受體煙堿性α7 基因（CHRNA7）參與SCZ 患者的認(rèn)知內(nèi)表型，有研究認(rèn)為其啟動(dòng)子甲基化會(huì)導(dǎo)致SCZ 患者中該基因表達(dá)降低[47]。Misiak 等[48]發(fā)現(xiàn)糖皮質(zhì)激素受體基因（NR3C1）在首發(fā)SCZ 患者中甲基化水平顯著降低，SCZ 家族性高危人群中甲基化水平升高，且NR3C1基因的高甲基化水平與認(rèn)知功能障礙有關(guān)。Liu L 等[49]發(fā)現(xiàn)，鹽皮質(zhì)激素受體基因（NR3C2）DNA 甲基化與SCZ 的性別依賴有關(guān)，且具有性別特異性效應(yīng)。此外Liu L 等[50]對(duì)SCZ 患者可溶性載體家族6-4 號(hào)基因（SLC6A4）的研究也發(fā)現(xiàn)SLC6A4的甲基化水平在女性明顯高于男性。SCZ 組SLC6A4甲基化水平與SCZ 顯著相關(guān)。以上這些研究結(jié)果表明多個(gè)基因DNA 甲基化與SCZ 密切相關(guān)。

5 小結(jié)

在SCZ 患者的DNA 甲基化研究中，發(fā)現(xiàn)諸如MAOA、COMT、GAD1、BDNF、RELN等諸多基因的DNA 甲基化與SCZ 有關(guān)。然而，受環(huán)境等諸多因素的影響，研究結(jié)果的一致性和可重復(fù)性仍較有限，需要對(duì)吸煙、飲酒、病程、用藥、年齡等諸多環(huán)境因素進(jìn)行控制。目前的研究也已經(jīng)注意到這些局限性，可以使用SCZ 的動(dòng)物模型來對(duì)上述局限性因素加以控制，開展新的動(dòng)物模型驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)。此外，要清楚地了解DNA 甲基化對(duì)SCZ 的影響，需要進(jìn)一步了解SCZ 患者不同檢材中DNA 的甲基化差異。同時(shí)，也需要更進(jìn)一步了解不同基因的甲基化在SCZ 患者中對(duì)基因表達(dá)調(diào)控的影響。展望進(jìn)一步的研究，在分子水平以及細(xì)胞水平開展更多的功能驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)以及細(xì)胞驗(yàn)證試驗(yàn)，同樣也是研究DNA 甲基化與SCZ 的重要環(huán)節(jié)。