低強(qiáng)度脈沖超聲作用于膝骨關(guān)節(jié)炎炎癥相關(guān)信號通路的研究進(jìn)展

歐陽輝，林星瑾，王金英，沈龍彬，王成棟

1 暨南大學(xué)附屬第一醫(yī)院，廣東 廣州 510630；

2 暨南大學(xué)，廣東 廣州 510620

膝骨關(guān)節(jié)炎（knee osteoarthritis，KOA）是一種由多因素引起的以軟骨侵蝕、滑膜炎癥、軟骨下骨增厚及骨贅形成為病理改變，涉及關(guān)節(jié)及關(guān)節(jié)周圍組織結(jié)構(gòu)病變的全關(guān)節(jié)疾病。危險因素包括年齡、性別、肥胖、創(chuàng)傷和代謝等［1-3］。KOA 在我國的致殘率約為53%，是第三大致殘疾病［4］。其發(fā)病主要涉及關(guān)節(jié)軟骨的合成和分解代謝的失衡，細(xì)胞因子的啟動與其密切相關(guān)。研究顯示，骨關(guān)節(jié)炎病理改變涉及軟骨細(xì)胞、破骨細(xì)胞、成骨細(xì)胞、滑膜中的成纖維細(xì)胞和單核細(xì)胞等多種細(xì)胞類型［5］。關(guān)節(jié)軟骨損傷后白細(xì)胞介素-1β（interleukin-1β，IL-1β）、IL-6 和腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）高表達(dá)，其中IL-1β 和TNF-α 是促進(jìn)炎癥發(fā)展及誘導(dǎo)軟骨下骨破壞的關(guān)鍵細(xì)胞因子，其出現(xiàn)于KOA 的多條致病信號通路中，調(diào)控KOA 的細(xì)胞內(nèi)活動，在軟骨細(xì)胞破壞、細(xì)胞外基質(zhì)減少、軟骨重塑異常、軟骨下骨化和滑膜炎癥等病理過程中扮演重要的角色［5-6］。目前臨床不斷尋求藥物或非藥物治療方法來調(diào)控軟骨代謝或阻斷促炎因子的表達(dá)，以期促進(jìn)軟骨修復(fù)或抑制軟骨破壞［7-8］。國內(nèi)外指南均提倡針對KOA 以非藥物治療為首選，包括患者教育、運動治療及物理治療等［9-10］。超聲治療作為一種無創(chuàng)安全的物理治療手段，在KOA 的治療上已經(jīng)有60多年的歷史［11］，研究較多且療效較好的強(qiáng)度為0.02～1 W/cm2、頻率為1～3 MHz 的低強(qiáng)度脈沖超聲（low-intensity pulsed ultrasound，LIPUS）。LIPUS 作用于KOA 具有減輕關(guān)節(jié)炎癥、緩解疼痛、促進(jìn)軟骨再生和保護(hù)軟骨的作用［12-13］。通過對LIPUS 作用于KOA 炎癥相關(guān)信號通路的研究進(jìn)展進(jìn)行綜述，可以為LIPUS的臨床應(yīng)用尋找最佳干預(yù)方案。

1 LIPUS的作用機(jī)制

LIPUS 是一種機(jī)械波，其聲能可通過介質(zhì)傳播到組織間和細(xì)胞內(nèi)，在組織細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生微氣泡和微射流，引起分子間的振動和碰撞，產(chǎn)生非熱效應(yīng)和熱效應(yīng)，從而使組織細(xì)胞產(chǎn)生一系列生物效應(yīng)。其中非熱效應(yīng)主要包括空化效應(yīng)、聲流和機(jī)械刺激等［14］。而關(guān)節(jié)組織對機(jī)械刺激非常敏感，適度的機(jī)械刺激可調(diào)節(jié)關(guān)節(jié)的穩(wěn)態(tài)，維持軟骨的正常代謝［15］。既往研究發(fā)現(xiàn)，LIPUS 通過非熱效應(yīng)在治療骨折和骨不連等方面具有良好的療效［16-17］，另外LIPUS在控制炎癥和促進(jìn)軟組織修復(fù)等方面也具有良好作用［18-19］。與其他強(qiáng)度的治療性超聲相比，LIPUS 具有最小的熱效應(yīng)，且能將聲能定向傳遞到靶組織中，在生物信號傳遞上具有優(yōu)越性［14］。利用LIPUS這一特性，可以調(diào)控膝骨關(guān)節(jié)中細(xì)胞的信號通路，改變細(xì)胞的理化性質(zhì)，促進(jìn)細(xì)胞新陳代謝，控制膝骨關(guān)節(jié)的炎癥。

2 LIPUS對膝骨關(guān)節(jié)炎作用的信號通路研究

近年來LIPUS 已廣泛應(yīng)用于KOA 的臨床治療，LIPUS 與藥物或其他治療方法聯(lián)合應(yīng)用對KOA 的疼痛、膝關(guān)節(jié)功能改善、炎癥控制和關(guān)節(jié)軟骨修復(fù)等方面具有明顯的治療優(yōu)勢。高明霞等［20］應(yīng)用LIPUS 聯(lián)合藥物干預(yù)KOA 患者6 周后，與單獨應(yīng)用藥物組對比，在視覺模擬評分（visual analogue scale，VAS）、西安大略和麥克馬斯特大學(xué)骨關(guān)節(jié)炎指數(shù)（Western Ontario and McMaster Universities Osteoarthritis Index，WOMAC）及Lysholm 膝關(guān)節(jié)評分（Lysholm knee score scale，LKSS）方面改善更明顯，且差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。亦有針對KOA 患者的臨床研究將口服藥物與LIPUS 聯(lián)合使用，相較單獨口服雙氯芬酸鈉組患者血清組織金屬蛋白酶抑制因子-2（tissue inhibitor of metalloproteinases-2，TIMP-2）的生成增加而關(guān)節(jié)軟骨基質(zhì)金屬蛋白酶-13（matrix metalloproteinase-13，MMP-13）的表達(dá)減少更顯著，顯示LIPUS 對軟骨修復(fù)有積極作用［21］。除了運用量表與血清學(xué)檢測作為評估療效的手段外，通過影像學(xué)MRI 檢測，也能觀察到超聲聯(lián)合藥物對關(guān)節(jié)軟骨的修復(fù)作用，從不同角度揭示了藥物聯(lián)合超聲治療KOA 的機(jī)制［22］。此外，非藥物聯(lián)合治療的臨床應(yīng)用也逐漸興起，如王廣等［23］運用本體感覺聯(lián)合LIPUS 與單純本體感覺訓(xùn)練治療KOA 患者12周，通過比較其VAS、WOMAC 及跌倒效能量表評分（modified fall efficacy scale，MFES），結(jié)果顯示前者改善更明顯，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），表明LIPUS 在各類聯(lián)合治療中對KOA 的抗炎作用。KOA 的發(fā)病和治療機(jī)制并不依賴于單個細(xì)胞因子，相同的信號通路可以被不同的細(xì)胞因子激活。在LIPUS 對KOA 炎癥相關(guān)信號通路作用機(jī)制的研究中，基礎(chǔ)研究主要包括對滑膜細(xì)胞、軟骨細(xì)胞和間充質(zhì)干細(xì)胞（mesenchymal stem cells，MSCs）的作用等方面，其成果值得臨床研究借鑒，以期針對KOA的不同發(fā)病機(jī)制選擇適合的治療參數(shù)和作用靶點，并聯(lián)合不同藥物，最終提高臨床療效。

2.1 LIPUS對滑膜細(xì)胞作用

隨著人體衰老，膝關(guān)節(jié)軟骨中裂解的細(xì)胞外基質(zhì)片段（如多糖和蛋白聚糖）被釋放到關(guān)節(jié)腔中，激活滑膜細(xì)胞（主要包括巨噬細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、樹突樣滑膜細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞等［24］）上的Toll樣受體（Tolllike receptors，TLRs）、晚期糖基化終產(chǎn)物受體（receptor for advanced glycation end products，RAGE），以及滑膜細(xì)胞內(nèi)的核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域樣受體蛋白3（nucleotide-binding oligomerization domain-like receptor and pyrin domain-containing protein 3，NLRP3）炎癥小體，進(jìn)一步級聯(lián)激活以核因子活化B 細(xì)胞κ輕鏈增強(qiáng)子（nuclear factor kappa-light-chain-enhancer of activated B cells，NF-κB）信號通路和絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinases，MAPKs）信號通路為主要途徑的細(xì)胞內(nèi)途徑，產(chǎn)生炎性介質(zhì)如IL-1β、IL-6 和TNF-α 并釋放入滑液中［25］，介導(dǎo)滑膜無菌性炎癥的產(chǎn)生。目前研究發(fā)現(xiàn)，LIPUS 具有抗炎的作用，LIPUS 可能通過干預(yù)滑膜細(xì)胞上的NLRP3 炎癥小體通路及自噬通路發(fā)揮抗炎作用［26-27］。2020 年的1 項研究應(yīng)用脂多糖-三磷酸腺苷處理滑膜巨噬細(xì)胞，促使巨噬細(xì)胞分泌的IL-1β 顯著增加，模擬膝骨關(guān)節(jié)炎的炎癥過程［28］，然后進(jìn)行LIPUS 的治療，發(fā)現(xiàn)巨噬細(xì)胞膜中釋放出的NLRP3 炎癥小體信號通路中的關(guān)鍵酶——半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶1（Caspase 1）裂解受到抑制，進(jìn)一步抑制前體IL-1β 的加工［29］，從而使成熟IL-1β減少。除了抑制NLRP3 炎癥小體信號通路中Caspase 1 外，這項研究還發(fā)現(xiàn)LIPUS 可以通過促進(jìn)丙酮酸激酶（pyruvate kinase muscle，PKM）的自噬來抑制滑膜組織中IL-1β，或通過增強(qiáng)PKM 和螯合體1的結(jié)合，進(jìn)而促進(jìn)溶酶體等自噬小體降解PKM，抑制成熟IL-1β的產(chǎn)生，最終發(fā)揮抗炎作用［28］。見圖1。另一方面，IL-1β 等炎癥因子的刺激同時也導(dǎo)致成纖維細(xì)胞的增生和滑膜的纖維化。LIAO 等［30］發(fā)現(xiàn)LIPUS 可通過抑制從OA 患者滑膜中分離出的成纖維細(xì)胞上的經(jīng)典無翅型MMTV 整合位點家族蛋白（wingless-type MMTV integration site family，Wnt）/β-連環(huán)蛋白信號通路，從而抑制成纖維細(xì)胞的增殖及減少滑膜纖維化。Wnt/β-連環(huán)蛋白信號通路作為典型的Wnt 信號通路，是KOA 的炎癥相關(guān)通路，存在于關(guān)節(jié)的滑膜和軟骨中，參與KOA 的病理過程［31］。此研究表明，LIPUS 可通過經(jīng)典Wnt 信號通路來抑制成纖維細(xì)胞增殖。以上研究闡述了LIPUS可能通過NLRP3 炎癥小體通路、自噬通路和經(jīng)典Wnt 信號通路，來分別影響滑膜中巨噬細(xì)胞和成纖維細(xì)胞的細(xì)胞活動，達(dá)到控制炎癥的效果。見圖2。

圖1 LIPUS通過干預(yù)滑膜細(xì)胞上的NLRP3炎癥小體通路及自噬通路發(fā)揮抗炎作用Figure 1 LIPUS exerts anti-inflammatory effects by interfering with the NLRP3 inflammatory vesicle pathway and autophagic pathway on synovial cells

圖2 LIPUS對滑膜細(xì)胞的作用Figure 2 Action of LIPUS on synovial cells

2.2 LIPUS對軟骨細(xì)胞作用

隨著KOA 的進(jìn)展，大量炎癥因子進(jìn)入滑液后刺激軟骨細(xì)胞，通過NF-κB 及MAPKs 等多種信號通路，產(chǎn)生如基質(zhì)金屬蛋白酶和聚集蛋白聚糖酶等軟骨降解產(chǎn)物，介導(dǎo)軟骨細(xì)胞的破壞［31-33］。LIPUS 通過抑制NF-κB 通路而阻斷軟骨細(xì)胞的破壞過程。UDDIN等［34］發(fā)現(xiàn)，LIPUS的機(jī)械刺激作用可以激活人軟骨細(xì)胞上的整合素及牽張活化通道，使得IL-1β誘導(dǎo)的細(xì)胞質(zhì)內(nèi)NF-κB 的蛋白質(zhì)磷酸化被抑制，通過抑制核轉(zhuǎn)錄，降低了細(xì)胞中MMP-13 和聚集蛋白聚糖酶-5 mRNA的表達(dá)，從而減少軟骨細(xì)胞MMP-13和聚集蛋白聚糖酶-5 的生成，使Ⅱ型膠原蛋白（collagen type Ⅱ，Col Ⅱ）降解減緩，同時增加細(xì)胞外基質(zhì)的合成，抑制軟骨分解代謝，刺激軟骨分化，最終起到保護(hù)軟骨的作用。除此之外，LIPUS 還可作用于軟骨中的MAPK 通路。MAPK 是一類廣泛存在于真核細(xì)胞中的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶。MAPK中與KOA發(fā)病相關(guān)的酶主要有細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶（extracellular regulated protein kinases，ERK）、p38絲裂原活化蛋白激酶（p38 mitogen-activated protein kinase，p38 MAPK）和Jun 氨基末端激酶［17］。有學(xué)者提出LIPUS 可能是通過促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)Ca2+內(nèi)流來產(chǎn)生上述作用，LIPUS 產(chǎn)生的機(jī)械刺激激活瞬時受體電位香草素受體4 型通道蛋白（TRPV4），這種通過機(jī)械應(yīng)力激活的鈣通道，使Ca2+向細(xì)胞內(nèi)流，進(jìn)一步激活p38 MAPK通路及ERK1/2通路［35］。以上2種信號通路共同促進(jìn)CCN 家族蛋白2/結(jié)締組織生長因子（CCN family 2/connective tissue growth factor，CCN2/CTGF）的產(chǎn)生。CCN2 是LIPUS 作用于軟骨細(xì)胞產(chǎn)生效應(yīng)所需要的物質(zhì)［36］，可促進(jìn)軟骨細(xì)胞中Col Ⅱa1 和Acan 基因的表達(dá)（產(chǎn)物為Col Ⅱ和聚集蛋白聚糖），起到增加細(xì)胞外基質(zhì)的作用。SEKINO等［37］也發(fā)現(xiàn)LIPUS 可以使小鼠軟骨細(xì)胞內(nèi)ERK1/2的活性和聚集蛋白聚糖的合成增加，MMP-13 的表達(dá)降低，增強(qiáng)軟骨細(xì)胞分化和細(xì)胞外基質(zhì)合成，最終促進(jìn)軟骨的合成。沈士浩等［38］則從不同角度揭示了LIPUS 對軟骨細(xì)胞的作用，該團(tuán)隊提出LIPUS可能通過激活兔軟骨細(xì)胞中整合素-黏著斑激酶（focal adhesion kinase，F(xiàn)AK）-MAPK 通路來減輕KOA 對軟骨的破壞。在LIPUS 機(jī)械刺激的作用下，整合素被激活，進(jìn)一步激活FAK，調(diào)控下游的MAPK水平，使ERK1/2、p38 磷酸化水平下降，最終促進(jìn)Col Ⅱ的合成及減少MMP-13 的產(chǎn)生來保護(hù)軟骨。這些結(jié)果說明LIPUS的機(jī)械刺激通過直接作用于軟骨細(xì)胞上不同的靶點，對軟骨細(xì)胞中2 種主要信號通路產(chǎn)生不同的作用，來抑制軟骨降解產(chǎn)物的產(chǎn)生，抑制軟骨分解，促進(jìn)軟骨合成，調(diào)控軟骨代謝過程，延緩膝骨關(guān)節(jié)炎的進(jìn)展。

2.3 LIPUS誘導(dǎo)MSCs再生軟骨

除以上對滑膜及軟骨的治療機(jī)制外，近年來LIPUS 的研究熱點逐漸趨于其對MSCs 的影響［39-40］。LIPUS 還可通過影響MSCs的增殖、分化及遷移來達(dá)到修復(fù)軟骨的目的。MSCs是多能干細(xì)胞，廣泛分布于滑膜、骨髓和骨骼肌等組織中，可增殖分化為多種細(xì)胞，如成骨細(xì)胞、基質(zhì)細(xì)胞、軟骨細(xì)胞等，其遷移到受損軟骨組織中，具有修復(fù)軟骨的作用，在治療KOA 方面有巨大的潛力［41］。LING 等［42］和CHEN等［43］研究指出，LIPUS 通過激活磷脂酰肌醇3-激酶（phosphoinositide 3 kinase，PI3K）-蛋白激酶B（protein kinase B，Akt）信號通路和ERK1/2信號通路，促進(jìn)人羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞的細(xì)胞增殖周期進(jìn)入周期蛋白合成時期，從而上調(diào)細(xì)胞周期蛋白的表達(dá)，誘導(dǎo)MSCs 的增殖。XIA 等［44］觀察到LIPUS 的機(jī)械刺激可使添加了轉(zhuǎn)化生長因子-β1（transforming growth factor-beta 1，TGF-β1）的體外培養(yǎng)的大鼠骨髓MSCs 中的Col Ⅱ和聚集蛋白聚糖的基因表達(dá)增加而使Col Ⅰ的基因表達(dá)降低，促進(jìn)MSCs分化形成軟骨細(xì)胞，修復(fù)軟骨。這個過程可能是通過促進(jìn)骨髓MSCs 中的整合素-雷帕霉素的機(jī)制靶點（mammalian target of rapamycin，mTOR）信號通路來實現(xiàn)的。1 項大鼠體內(nèi)外研究給出了更加新穎的觀點，即LIPUS 可通過調(diào)節(jié)自噬來促進(jìn)骨髓來源的MSCs外泌體釋放［45］，進(jìn)一步增加Col Ⅱ等細(xì)胞外基質(zhì)以保護(hù)軟骨，此類外泌體也可通過抑制由IL-1β 激活的NF-κB 途徑修復(fù)軟骨［46］。因此LIPUS 除了直接抑制軟骨破壞外，還可促進(jìn)注射至關(guān)節(jié)腔的骨髓MSCs 分泌的外泌體修復(fù)軟骨。另外，LIPUS 的機(jī)械應(yīng)力可激活MSCs中的自噬通路并使其發(fā)生遷移，且此過程可被自噬抑制劑所抑制，但對自噬通路的激活過程及如何引起MSCs 的遷移并未具體闡明［47］。未來還需更多研究闡述LIPUS 在MSCs 遷移中的作用。近年的研究發(fā)現(xiàn)LIPUS通過多種經(jīng)典的信號通路，在MSCs 的增殖、分化、遷移及其生物活性物質(zhì)的產(chǎn)生、作用等方面產(chǎn)生效應(yīng)，介導(dǎo)膝關(guān)節(jié)軟骨代謝的調(diào)控，減緩KOA的發(fā)展。見圖3。

圖3 LIPUS對軟骨的作用Figure 3 Effect of LIPUS on cartilage

3 討 論

綜上所述，LIPUS 主要通過影響自噬、Wnt/β-連環(huán)蛋白、MAPKs、NF-κB、PI3K-Akt 和整聯(lián)蛋白-mTOR 等信號通路對膝關(guān)節(jié)中的滑膜細(xì)胞、軟骨細(xì)胞及骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的細(xì)胞活動起積極作用。LIPUS 可通過增強(qiáng)巨噬細(xì)胞的自噬途徑及抑制NLRP3 炎癥小體通路使巨噬細(xì)胞產(chǎn)生的IL-1β 減少，減輕炎癥反應(yīng)。也可通過機(jī)械刺激抑制IL-1β誘導(dǎo)的NF-κB 途徑及激活MAPK 通路，來調(diào)節(jié)軟骨的分泌代謝，促進(jìn)軟骨細(xì)胞生成細(xì)胞外基質(zhì)，保護(hù)軟骨。在骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞方面，LIPUS 激活ERK1/2 和PI3K-Akt 信號通路促進(jìn)MSCs 增殖分化，也通過整聯(lián)蛋白-mTOR 信號通路來促進(jìn)MSCs產(chǎn)生TGF-β1，促進(jìn)軟骨形成。另一方面，LIPUS 還可促進(jìn)MSCs分泌外泌體，通過抑制IL-1β 誘導(dǎo)的NF-κB 途徑改變軟骨代謝，間接保護(hù)軟骨。最近研究也發(fā)現(xiàn)LIPUS通過激活自噬來促進(jìn)MSCs 的遷移。通過對LIPUS在KOA 炎癥相關(guān)信號通路上不同作用途徑的探索，有利于實現(xiàn)LIPUS 更精準(zhǔn)的治療。此外，干細(xì)胞新技術(shù)治療骨關(guān)節(jié)炎疾病的臨床試驗已陸續(xù)開始在國內(nèi)開展［10］，未來應(yīng)進(jìn)一步尋找LIPUS 對膝關(guān)節(jié)內(nèi)其他細(xì)胞或物質(zhì)的影響通路，或進(jìn)一步探究通過LIPUS的物理刺激讓干細(xì)胞定向分化為軟骨細(xì)胞并誘導(dǎo)其遷移修復(fù)受損軟骨的可行性，為臨床研究及聯(lián)合治療方案提供理論依據(jù)。