云南黑松露醇提物對小鼠T淋巴細胞免疫調節作用

蘇銀芳,徐梓涵,袁雨欣,李干鵬,祁艷艷,王芳,蔡正達

(1.云南民族大學民族藥資源化學國家民族事務委員會-教育部重點實驗室,昆明 650500;2.云南省科學技術院,昆明 650500)

免疫是人體維持健康的重要生理機能。免疫力低下時,機體對外來入侵物質識別及防御能力降低,可引發多種疾病。因此,借助增強機體免疫能力控制疾病發生、發展一直是醫學研究的關注點[1]。免疫系統功能主要涉及免疫防御、免疫監視、免疫自穩三個方面,三者對機體的整體免疫功能十分重要[2]。T淋巴細胞來源于骨髓多能干細胞,分布于外周免疫器官的胸腺依賴區,發揮細胞免疫及免疫調節等功能。功能性T細胞中輔助性T細胞包括Th1和Th2細胞,Th1細胞代謝產生的相關細胞因子主要有白細胞介素2(IL-2)、IL-12以及γ干擾素(IFN-γ),而這些細胞因子在介導細胞免疫應答反應中起關鍵作用[3]。天然產物中多糖成分具有機體免疫調節作用,多糖及多糖肽可以通過激活T細胞和B細胞,促使其增殖及提高對不同免疫細胞的分泌,因此受到免疫藥理學研究者關注[4]。

松露學名黑孢塊菌(Tuber melanosporum),屬真菌門子囊菌綱塊菌目塊菌屬食用真菌[5]。云南黑松露常被稱為“豬拱菌”,是一種可以藥食兩用十分稀有珍貴的野生食用菌,但目前其調節免疫作用的研究筆者較少見到報道。筆者在本研究通過小鼠脾淋巴細胞炎癥模型,觀察云南黑松露醇提物對小鼠T細胞免疫的調節活性,以期為進一步研究其免疫調節作用提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1實驗動物 BALB/c純系小鼠,雌性,6～7周齡,體質量18～22 g,購自北京華阜康實驗動物有限公司,實驗動物生產許可證號:SCXK(京)2019-0008,飼養于云南民族大學民族醫藥學院清潔級動物房,保持光照、黑暗各12 h恒定循環,自由活動、進食、飲水。環境溫度25 ℃,相對濕度40%～60%。實驗操作符合《國家實驗動物健康與管理條例》要求。

1.2藥品與試劑 云南黑松露購自云南省昆明市中藥材市場,經云南民族大學民族醫藥學院孫靜賢副教授鑒定為黑松露(Tuber melanosporum)。細胞實驗所用RPMI-1640培養基及胎牛血清(FBS)均購自BI公司(批號分別為2210060,2144324);無菌紅細胞裂解液購自天根生化科技(北京)有限公司(批號:20160418);IFN-γ與IL-2酶聯免疫試劑盒均購自美國Invitrogen公司(批號分別為219145-008,222653-005);IFN-γ蛋白抗體購自美國Affinity公司(批號:11p5029);聚丙烯酰胺(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electro-phoresis,SDS-PAGE)凝膠快速配制試劑盒購自上海碧云天生物技術有限公司(批號:051722220526);化學發光底物(enhanced chemiluminescence,ECL)顯色試劑盒購自上海愛必信生物科技有限公司(批號:ZN18A01);Mouse TH1/TH2 Staining Kit 購自杭州聯科生物技術股份有限公司(批號:A11015);色譜級甲醇購自美國Fisher scientific公司;娃哈哈純凈水;氘代-甲醇(批號:1455-13-6)、氘代三氯甲烷(批號:865-49-6)、氘代-二甲亞砜(DMSO,批號:2206-27-1)等試劑購自上海麥克林生化科技有限公司。

1.3儀器與設備 Shimadzushim-pack GIS-C18型反相半制備柱(250 mm×10 mm,5 μm,日本島津公司);Zorbax Eclipse XDB-C18型分析柱(美國安捷倫儀器分析有限責任公司);EYELA旋轉蒸發儀(日本東京理化器械株式會社);ZF-7暗箱式三用紫外分析儀(上海嘉鵬科技有限公司);Multiskan Go多功能酶標儀(美國Thermo);二氧化碳培養箱(美國Thermo-fisher);5417R高速離心機(Eppendorf);SDS-凝膠電泳體系(美國Bio-RAD公司);CytoFLEX LX流式細胞儀(美國貝克曼庫爾特有限公司)。

1.4云南黑松露的提取分離 取云南黑松露30 g,分別用75%和95%乙醇熱浸超聲提取7 次(42 ℃),每次8 h,每次用量12 L,合并提取液濾過、減壓濃縮后各得浸膏4和3.6 g,以乙酸乙酯萃取得到乙酸乙酯部分和水相部分。取1 g兩種比例乙醇提取物的水相部分浸膏分別經Zorbax Eclipse XDB-C18型分析柱進行梯度洗脫、分離。分離體系為:10%,30%,60%,80%甲醇-水溶液和100%甲醇,依據薄層色譜分析結果將相同成分段進行合并。取兩種比例乙醇提取物的乙酸乙酯部分1 g經Sephadex LH-20 凝膠柱色譜(100%甲醇)進行分離。

1.5實驗試劑的制備 ①取云南黑松露樣品100 mg,溶于DMSO 1 mL,配制成100 mg·mL-1母液。使用時,依據實驗所需,以含10%FBS的RPMI-1640培養基稀釋至目標濃度。②ConA的配制:取ConA 3 mg,溶解于RPMI-1640 培養基100 μL,配制成30 mg·mL-1母液,使用時以相應培養液稀釋成0.3 μg·mL-1液體,濾過,分裝備用。③Anti-CD3采用滅菌PBS 緩沖液配制成2 mg·mL-1母液,終濃度2 μg·mL-1。④噻唑藍(MTT)溶液的配制:取MTT50 mg,溶解于PBS緩沖液10 mL,母液濃度5 mg·mL-1,濾過除菌后-20 ℃冰箱貯存備用。

1.6小鼠脾淋巴細胞懸液的制備 取BALB/c雌性小鼠1或2 只,處死,75%乙醇浸泡后超凈工作臺取脾臟,置10%FBS的RPMI-1640培養基3 mL充分研磨,200目金屬網過濾到EP 管,1200 r·min-1離心5 min(r=7.25 cm)。去上清液,加入紅細胞裂解液1～2 mL混勻,室溫靜置2 min,再次過濾、離心,冰浴備用。

1.7MTT檢測細胞增殖率 以含10% FBS的RPMI-1640培養液將小鼠脾淋巴細胞懸液調整為5×106個·mL-1,接種于96 孔板,每孔100 μL。設置陰性對照組、ConA 組和不同濃度云南黑松露分段樣品組。陰性對照組加10%FBS的RPMI-1640培養基100 μL,ConA組加10%FBS的RPMI-1640培養基和ConA溶液各50 μL,不同濃度云南黑松露分段樣品組加待測樣品和ConA溶液各50 μL,每組設復孔3個。將加樣后的96孔板置5%CO2、37 ℃培養箱培養48 h。48 h后每孔加入MTT溶液20 μL繼續培養2 h,離心,棄去上清液,每孔加DMSO150 μL,震蕩、溶解,570 nm波長處檢測吸光度(A值),計算細胞增殖率。細胞增殖率(%)=(實驗組A值-陰性對照組A值)/陰性對照組A值×100%。

1.8ELISA法檢測IL-2與IFN-γ 取24孔板,除陰性對照組外,每孔加入Anti-CD3試劑300 μL,置CO2培養箱培養4 h,吸去Anti-CD3試劑;陰性對照組與Anti-CD3組加入10% FBS的RPMI-1640 培養基500 μL,樣品處理組加入待測樣品500 μL。將小鼠脾淋巴細胞懸液濃度調整為2×106個·mL-1,每孔加入脾淋巴細胞懸液500 μL。每組設復孔3個。繼續培養24 h后,收集培養上清液,依據ELISA檢測試劑盒說明書進行IL-2與IFN-γ細胞因子含量測定。

1.9Western blotting法測定小鼠脾淋巴細胞IFN-γ蛋白表達量 重復“1.8”項操作,收集細胞,裂解蛋白。用10%SDS分離膠體系進行蛋白電泳,濕法轉膜,室溫封閉2 h,在相應條帶分別加入IFN-γ及β-actin一抗(1：1000),4 ℃搖床孵育過夜。PBS/T洗3次,每次5 min,加相應二抗(1：4000 ),室溫孵育2 h。PBS/T洗3次,每次5 min,加ECL顯影。圖像經Image J軟件測定灰度值,依據內參β-actin灰度值標準化分析IFN-γ,得到各待測蛋白樣品IFN-γ相對表達值。

1.10流式細胞術檢測CD3、CD4淋巴細胞 重復“1.8”項操作,培養24 h,收集細胞懸液至流式管,加入PMA /Ionomycin /BFA /Monensin Mixture(250x)1 μL。以只含細胞懸液的樣本為對照。混勻,37 ℃孵育4～6 h,每隔1～2 h取出震蕩混勻。從樣本管和對照管中取細胞懸液100 μL至新流式管,加入5 μL鼠抗CD3抗體,FITC和5 μL鼠抗CD4抗體,PerCP-Cy5.5。震蕩混勻,室溫避光孵育15 min。每管加入FIX &PERM MediumA 100 μL,震蕩混勻,室溫避光孵育15 min。每管加入預冷1×流式染色緩沖液2 mL,1 200 r·min-1離心5 min(r=7.25 cm),棄去上清液。每管加入FIX &PERM Medium B100 μL、Anti-Mouse IFN-γ和PE5 μL,Anti-Mouse IL-4 5 μL,APC。震蕩混勻,室溫避光孵育15 min。每管加入1x Flow Cytometry Staining Buffer 2 mL,1200 r·min-1離心5 min(r=7.25 cm),棄去上清液。每管加入1x Flow Cytometry Staining Buffer 500 μL重懸,上機檢測;或者加入1%～4 %多聚甲醛500 μL重懸,2～8 ℃避光,24 h檢測。

2 結果

2.1云南黑松露醇提物樣品組分分離提取結果 按“1.4 ”項方法,提取得到云南黑松露醇提物水相部分和乙酸乙酯部分。水相部分經過Zorbax Eclipse XDB-C18型分析柱分離得到樣品8個,記作1-8號組分;乙酸乙酯部分經過Sephadex LH-20凝膠柱色譜洗脫分離得到樣品9個,記作A-I號組分。

2.2云南黑松露醇提物對小鼠脾淋巴細胞增殖活性的影響 對上述分離獲得的17個組分進行小鼠脾淋巴細胞增殖活性影響檢測。結果顯示1號組分、2號組分、F號組分和G號組分在濃度為0.8～20 μg·mL-1范圍內對該細胞具有促進增殖作用,結果見圖1。

A.云南黑松露醇提物水相部分;B.云南黑松露醇提物乙酸乙酯部分。圖1 云南黑松露醇提物對ConA 誘導小鼠脾淋巴細胞增殖的影響 A.Aqueous part in alcohol extract of Yunnan black truffle;B.Ethyl acetate part in alcohol extract of Yunnan black truffle.Fig.1 Effect of alcohol extract of Yunnan black truffle on ConA-induced proliferation of mouse spleen lymphocytes

2.31、2、F和G號組分對小鼠脾淋巴細胞增殖的影響 結果見表1與表2。結果顯示,1號組分在20 μg·mL-1時促增殖作用最佳[增殖率(86.11±3.12)%],2號組分在40 μg·mL-1下呈現出與1號組分相當的促增殖作用[增殖率(86.27±7.45)%];F和G號組分在0.8和4 μg·mL-1均呈現出一定促增殖作用,其中F號組分在0.8 μg·mL-1即呈現出較好促增殖活性,增殖率(88.81±0.49)%,差異有統計學意義(P<0.01)。

表1 云南黑松露醇提物水相部分對小鼠脾淋巴細胞增殖率的影響Tab.1 Effect of aqueous part in alcohol extract of Yunnan black truffle on the proliferation rate of mouse spleen lymphocytes

表2 云南黑松露醇提物乙酸乙酯部分對小鼠脾淋巴細胞增殖率的影響Tab.2 Effect of ethyl acetate part in alcohol extract of Yunnan black truffle on the proliferation rate of mouse spleen lymphocytes

2.41、2、F和G號組分對小鼠脾淋巴細胞分泌IFN-γ、IL-2的影響 采用ELISA 法檢測系列濃度1、2、F和G號組分對脾淋巴細胞培養上清液中IL-2與IFN-γ 細胞因子的影響。結果見圖2-3。在Anti-CD3刺激下,1號組分在80 μg·mL-1時對小鼠脾淋巴細胞分泌IL-2促進作用顯著高于Anti-CD3組,差異有統計學意義(P<0.05),IFN-γ濃度并未表現出明顯差異;2號組分則對這兩個細胞因子均未顯示出促進作用。

①與Anti-CD3 組比較,t=3.887,P<0.05。圖2 1號組分對小鼠脾淋巴細胞細胞因子的影響 ①Compared with Anti-CD3 group,t=3.887,P<0.05.Fig.2 Effects of Component 1 on cytokines in mouse spleen lymphocytes

圖3 2號組分對小鼠脾淋巴細胞細胞因子的影響Fig.3 Effects of Component 2 on cytokines in mouse spleen lymphocytes

在Anti-CD3刺激下,F號組分在0.625～2.5 μg·mL-1濃度范圍內促進小鼠脾淋巴細胞分泌IFN-γ作用顯著高于Anti-CD3刺激組,且呈現較好的濃度依賴性,差異有統計學意義(P<0.01),但對IL-2 分泌無明顯促進作用(圖4)。

①與Anti-CD3組比較,t=5.814,5.117,10.38,P<0.01。圖4 F號組分對小鼠脾淋巴細胞細胞因子的影響 ①Compared with Anti-CD3 group,t=5.814,5.117,10.38,P<0.01.Fig.4 Effects of component F on cytokines in mouse spleen lymphocytes

在Anti-CD3刺激下,G號組分對小鼠脾淋巴細胞分泌IL-2作用未見明顯差異,而與Anti-CD3組相比,G號組分可顯著促進IFN-γ分泌,差異有統計學意義(P<0.05)。隨著G號組分濃度增高,其對IFN-γ的作用有所降低(圖5)。

①與Anti-CD3組比較,t=4.012,P<0.05。圖5 G號組分對小鼠脾淋巴細胞細胞因子的影響 ①Compared with Anti-CD3 group,t=4.012,P<0.05.Fig.5 Effects of component G on cytokines in mouse spleen lymphocytes

2.51、2、F和G號組分對小鼠脾淋巴細胞IFN-γ 表達水平的影響 依據 “2.3”和“2.4”項實驗結果,將黑松露醇提物1、2、F和G號組分進行Western blotting 實驗,探討其對IFN-γ 蛋白表達是否有影響。如蛋白表達水平檢測結果所示:與Anti-CD3組相比,1號組分在20～80 μg·mL-1時對IFN-γ蛋白表達水平影響有一定趨勢,濃度為80 μg·mL-1時差異有統計學意義(P<0.01);2號組分在在20～80 μg·mL-1時顯著提高IFN-γ蛋白表達水平,并且具有較好的濃度依賴性(P<0.05或P<0.01);F號組分在0.625 ～2.5 μg·mL-1范圍內提高IFN-γ蛋白表達量,與Anti-CD3組相比,在2.5 μg·mL-1濃度下達到最大值(P<0.01);G號組分也與F號組分有類似趨勢,與Anti-CD3組相比,G號組分在1.25～2.5 μg·mL-1濃度顯著提高IFN-γ 蛋白表達量(P<0.01)。見圖6。

①與Anti-CD3組比較,t=3.931,6.992,6.831,5.992,3.857,6.138,P<0.01;②與Anti-CD3組比較,t=3.319,P<0.05。圖6 4種組分對小鼠脾淋巴細胞IFN-γ蛋白表達水平的影響①Compared with Anti-CD3 group,t=3.931,6.992,6.831,5.992,3.857,6.138,P<0.01;②Compared with Anti-CD3 group,t=3.319,P<0.05.Fig.6 Effects of four components on IFN-γ expression in mouse spleen

①與Anti-CD3組比較,t=11.34,P<0.05(n=5)。圖7 5組小鼠脾淋巴細胞中表達情況①Compared with Anti-CD3 group,t=11.34,P<0.05(n=5).Fig.7

①與Anti-CD3組比較,t=17.36,10.23,P<0.01。圖8 5組小鼠脾淋巴細胞中表達情況①Compared with Anti-CD3 group,t=17.36,10.23,P<0.01.Fig.8

2.81、2、F和G號組分對小鼠脾淋巴細胞Th1/Th2細胞比例的影響 結果見圖9。1 號組分組Th1細胞比例高于Anti-CD3組,差異有統計學意義(P<0.05)。2、G和F號組分組Th1細胞比例差異無統計學意義。1號組分組Th2細胞比例低于Anti-CD3組,G號組分組Th2 細胞比例高于Anti-CD3組,差異有統計學意義(P<0.05)。2、F號組分組與Anti-CD3組比較,差異無統計學意義。

①與Anti-CD3比較,t=7.151,9.087,3.974,P<0.05。圖9 5組小鼠脾淋巴細胞Th1 /Th2細胞表達情況①Compared with Anti-CD3 group,t=7.151,9.087,3.974,P<0.05.Fig.9 Expression of Th1 /Th2 cells in mouse spleen

3 討論

本實驗中,從云南黑松露提取分離得到17個組分,建立BALB/c小鼠脾淋巴細胞增殖模型以0.8～100 μg·mL-1濃度梯度進行活性篩選,1、2、F和G號4個組分在不同濃度下可促進脾淋巴細胞增殖,具有協同增強ConA對小鼠T淋巴細胞增殖的作用。研究表明,乙酸乙酯部分萃取樣品大多富含萜類化合物,而單萜烯可增強BALB/c小鼠的脾細胞增殖[12],與本研究結果相似。T細胞增殖作用對CTL、NK以及巨噬細胞增殖活化都具有一定促進作用,從而使機體分泌出更多IL-2、IFN-γ 等細胞因子。IFN-γ即Ⅱ型干擾素,同時也被稱為免疫干擾素,是一類具有較好抗病毒效果的生物活性物質,在免疫調節方面具有關鍵作用,并且還能促進各種免疫細胞因子的表達,從而達到提高機體分泌相關抗體的作用。本研究中,筆者通過ELISA 法檢測IFN-γ和IL-2水平,探討云南黑松露醇提物中1、2、F和G號組分對細胞因子的影響。結果顯示4 個組分在不同濃度下可促進T細胞分泌IFN-γ和IL-2濃度,而IFN-γ和IL-2高分泌表達可以促進Th1細胞活化,在營養學抗癌免疫前沿中具有重要作用。筆者采用Western blotting實驗,繼續探討這4個組分對IFN-γ蛋白表達的影響,結果顯示2、F和G號組分在相應濃度下可促進IFN-γ蛋白表達,進一步驗證了云南黑松露醇提物對Th1免疫反應的促進作用以及提高免疫調節活性作用[13]。