芹菜素對SH-SY5Y細胞內質網應激誘導凋亡的影響*

楊全偉,黃文濤,陳一璇,胡松

(武漢市第一醫院藥學部,武漢 430022)

神經元丟失是多種神經退行性疾病的主要誘發原因。神經損傷的臨床表現主要為記憶缺陷、震顫麻痹、舞蹈癥狀及肌肉萎縮等功能性障礙等,從而影響記憶、運動、思考、交流、吞咽和呼吸等功能。目前,減少或控制神經元損傷或丟失的方法或藥物仍然有待進一步發現。

現已證實內質網應激與神經退行性疾病發展進程密切相關。內質網內環境的穩定是實現內質網功能的基本條件,由于內質網應激常導致內質網內未折疊蛋白質或錯誤折疊蛋白的蓄積,誘導內質網應激標志蛋白的表達,如內質網應激球蛋白結合蛋白(globulin-binding protein,BIP)、C/EBP同源蛋白(C/EBP homologous protein,CHOP)及半胱氨酸天冬氨酸蛋白水解酶12(csyteine aspartic acic specific protease,Caspase-12)。一方面,內質網應激通過將信號逆向傳入細胞核,產生轉錄調控,保護細胞免受內質網應激導致的損傷[1];另一方面,長期高強度內質網應激,觸發內質網應激誘導的細胞凋亡發生[2],引起抗凋亡B細胞淋巴瘤-2蛋白(B cell lymphoma/leukemia-2,Bcl-2)與凋亡蛋白Bcl-2相關X蛋白(Bcl-2-associated X protein,Bax)比值改變。

芹菜素(apigenin,Api)又稱芹黃素、洋芹素,是一種黃酮類單體化合物,存在于多種果蔬(蘋果及芹菜等),尤以芹菜中含量最高。近年來研究發現,芹菜素具有多種生物學活性,如抗炎、抗氧化、抗腫瘤、抗衰老等作用,也可用于治療老年癡呆、帕金森病等神經退行性疾病[3]。雖然目前有文獻報道芹菜素可以通過抗氧化作用阻止1-甲基-4-苯基吡啶(1-methyl-4-phenylpyridinium,MPP+)誘導人神經母細胞瘤細胞(human neuroblastoma,SH-SY5Y)凋亡發生[4],防治帕金森病,但大部分研究集中于抗腫瘤領域,對芹菜素是否能抑制神經元丟失、尤其是內質網應激誘導的細胞凋亡發生筆者未見報道。筆者在本實驗以毒胡蘿卜素(thapsigargin,TG)誘導SH-SY5Y細胞產生內質網應激模型,探討芹菜素逆轉TG所致SH-SY5Y細胞內質網應激誘導凋亡的分子機制。

1 材料與方法

1.1試劑 BIP、CHOP、Bcl-2、Caspase-12、β激動蛋白(β-actin)、Bax 均購于武漢愛博泰克(ABclonal)生物科技有限公司,批號分別為A0241、A0221、A0209、A0217、AC026及A19684;芹菜素(含量≥98%)、4-苯丁酸(4-phenylbutyric acid,PBA,含量≥98%)購于上海阿拉丁生化科技有限公司,批號分別為A106676、#F1828076;TG購于默克中國有限公司(批號:67526-95-8,含量≥98%);改良Eagle(Dulbecco's modification of Eagle's medium,DMEM)培養基購于美國HyClone公司(批號:D5671);胎牛血清購于Gibco公司(批號:10099);二辛可寧酸(bicinchoninic acid,BCA)測定蛋白定量試劑盒、細胞計數試劑-8(cell counting kit-8,CCK-8)檢測試劑盒購于上海翊圣生物科技有限公司,批號分別為2021-A、40210ES10;強裂解液(radio immunoprecipitation assay,RIPA)購于杭州弗德生物科技有限公司(批號:FD008);SH-SY5Y細胞購于武漢谷歌生物有限公司,鑒定報告由武漢谷歌生物有限公司提供。

1.2儀器 水平搖床(海門市其林貝爾儀器制造有限公司,型號:TS-1);細胞培養箱(Thermo公司,型號:360);電泳槽、電轉膜儀(Bio-Rad公司,型號:165-8004);超凈工作臺(蘇州凈化公司,型號:SW-CT-2D);多功能酶標儀(美國Bio-Tek公司,型號:Synergy-2);化學發光凝膠成像系統(Bio-Rad公司,型號:ChemiDoTMXRS+)。

1.3細胞的培養 用含10%胎牛血清、青霉素(100 U·mL-1)和鏈霉素(100 mg·mL-1)的DMEM高糖培養基培養SH-SY5Y細胞,培養條件:37 ℃,5%二氧化碳(CO2),恒溫恒濕。隔天換培養基1次,細胞融合度達到80%傳代,進行下一步實驗。

1.4實驗分組 以TG制備內質網應激模型,研究內質網應激所致內源性凋亡途徑,如濃度和時間依賴性TG誘導內質網應激標記物BIP顯著增加,則判定為內質網應激造模成功。實驗分組[5]:對照組(CON組,2%胎牛血清DMEM高糖培養基)、TG組(以2%胎牛血清DMEM高糖培養基配制TG)、TG+芹菜素組(以2%胎牛血清DMEM高糖培養基配制TG與芹菜素)。

為考察TG造模最佳濃度與時間,設置TG濃度梯度為0.5、1.0、2.0、3.0 μmol·L-1;TG處理細胞時間分別為4、6、8、10 h。另外,當細胞貼壁密度達80%時,設置預防性給予芹菜素濃度分別為10、20、30 μmol·L-1,檢測細胞活力,觀察芹菜素在TG所致內質網應激發生的作用。用2%胎牛血清DMEM高糖培養基配制4-丁苯酸(PBA)濃度為1.5 mmol·L-1溶液,-4 ℃保存備用。PBA是內質保護劑,可抑制內質網應激。

1.5CCK-8法檢測細胞活性[6]取對數生長期細胞,調整細胞濃度為1×105個·mL-1,每孔100 μL接種于96孔板,在37 ℃、5%CO2條件下培養約24 h,按照“1.4節”分組方法給藥,給藥完成后,每孔加入CCK-8溶液10 μL,在37 ℃、5%CO2培養箱中給藥2 h,酶標儀在波長450 nm處測定各孔吸光度(A)值。細胞活力(%)=[A(加藥)-A(空白)]/[A(0加藥)-A(空白)]×100%。A(加藥)、A(空白)及A(0加藥):參照說明書指導方法,按是否含有細胞、CCK-8溶液和藥物溶液,測定A值。

1.6蛋白免疫印跡法(western blotting,WB)檢測內質網應激蛋白及凋亡蛋白表達[4]取對數生長期細胞,調整細胞濃度為2.5×105個·mL-1,接種于6孔板,37 ℃、5%CO2條件下,過夜培養12～14 h后,待次日細胞密度為70%～80%時,給予10 μmol·L-1芹菜素預處理1 h;隨后,1.0 μmol·L-1TG給藥10 h。收集細胞,PBS洗3次,加入RIPA,冰浴裂解15 min,收集細胞裂解液于1.5 mL離心管內;12 000 r·min-1離心10 min(r=6 cm),取上清液,采用BCA蛋白定量檢測法,酶標儀波長562 nm條件下測定蛋白含量。定量后的蛋白樣品采用10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gelelectrophoresis,SDS-PAGE)進行蛋白電泳,蛋白上樣量10～20 μg。電泳條件起始電壓60 V,到達分離膠后調整為120 V。轉膜條件為聚偏二氟乙烯(polyvinylidene fluoride,PVDF)膜恒流(電流300 mA)轉膜2 h。室溫下5%脫脂奶粉封閉1 h,4 ℃過夜,給藥一抗BIP(1：1000)、CHOP(1：1 000)、Bcl-2(1：1 000)、CASPASE-12(1：1 000)、Bax(1：1 000)以及β-actin(1：5 000)蛋白,TBST緩沖液洗3次,給藥二抗,ECL化學發光顯影,化學發光凝膠成像系統分別檢測蛋白表達水平。

2 結果

2.1芹菜素對TG誘導的SH-SY5Y細胞活力的影響 結果顯示,與CON組比較,隨著TG濃度增加,SH-SY5Y細胞活力呈劑量依賴性下降(P<0.01),當TG濃度>1.0 μmol·L-1時,細胞活力未見明顯改變,故選擇TG濃度1.0 μmol·L-1作為內質網應激誘導細胞凋亡的造模濃度。TG時間依賴性實驗結果顯示,與CON組比較,隨著TG處理時間延長,細胞活力均明顯下降(P<0.01)。TG處理10 h后,細胞活性降至最低。因此,選擇TG給藥時間為10 h。分別給予10、20、30 μmol·L-1芹菜素預處理細胞1 h,給予1.0 μmol·L-1TG誘導內質網應激下,確定10 μmol·L-1芹菜素預處理可明顯改善細胞活力(P<0.01)。因此本實驗選擇芹菜素預處理濃度為10 μmol·L-1,結果見圖1。

①與CON組比較,t=5.31～7.14,P<0.01;②與CON組比較,t=3.13～9.62,P<0.01 ;③與TG組比較,t=0.39～6.47,P<0.01。圖1 芹菜素對TG誘導的SH-SY5Y細胞活力的影響 ① Compared with CON group,t=5.31-7.14,P<0.01;② Compared with CON group,t=3.13-9.62,P<0.01;③ Compared with TG group,t=0.39-6.47,P<0.01.Fig.1 Effect of apigenin on the viability of SH-SY5Y cells induced by TG

2.2芹菜素對內質網應激相關蛋白BIP表達的影響 與CON組比較,TG組BIP表達明顯上調(P<0.01);與TG組比較,芹菜素預處理組BIP表達降低(P<0.05),TG+PBA組內質網應激被明顯抑制(P<0.05),見圖2。

①與CON組比較,t=5.25,P<0.01;②與TG組比較,t=3.81,2.397,P<0.05。圖2 芹菜素對BIP蛋白表達的影響① Compared with CON group,t=5.25,P<0.01;② Compared with TG group,t=3.81,2.397,P<0.05.Fig.2 Effect of apigenin on BIP protein

2.3芹菜素對內質網應激誘導蛋白CHOP表達的影響 WB結果顯示,與CON組比較,TG組CHOP蛋白表達顯著增多(P<0.01);與TG組比較,TG+芹菜素組CHOP表達顯著降低(P<0.05),見圖3。

①與CON組比較,t=9.43,P<0.01;②與TG組比較,t=4.61,P<0.05。圖3 芹菜素對CHOP蛋白表達的影響① Compared with CON group,t=9.43,P<0.01;②Compared with TG group,t=4.61,P<0.05.Fig.3 Effect of apigenin on CHOP protein

2.4芹菜素對內質網應激誘導的Caspase-12蛋白表達的影響 與CON組比較,TG組Caspase-12蛋白表達明顯增多(P<0.05);與TG組比較,TG+芹菜素組表達趨勢降低(P<0.05),見圖4。

①與CON組比較,t=3.02,P<0.05;②與TG組比較,t=4.56,P<0.05。圖4 芹菜素對Caspase-12蛋白的影響①Compared with CON group,t=3.02,P<0.05;②Compared with TG group,t=4.56,P<0.05.Fig.4 Effect of apigenin on Caspase-12 protein

2.5芹菜素對內質網應激誘導的Bcl-2/Bax蛋白表達的影響 與CON組比較,TG組抗凋亡蛋白Bcl-2表達明顯減少 (P<0.05),促凋亡蛋白Bax表達增多,Bcl-2/Bax比值顯著下降(P<0.05)。與TG組比較,TG+芹菜素組Bcl-2表達明顯上調(P<0.05),Bax表達也有下調趨勢,Bcl-2/Bax比值顯著增加 (P<0.05),結果見圖5。

①與CON組比較,t=3.31～5.67,P <0.05;②與TG組比較,t=2.84～5.16,P<0.05。圖5 芹菜素對BCL2/BAX蛋白表達的影響① Compared with CON group,t=3.31-5.67,P<0.05;② Compared with TG group,t=2.84-5.16,P<0.05.Fig.5 Effect of apigenin on BCL2/BAX protein

3 討論

神經退行性疾病的發生機制包括活性氧生成、線粒體功能障礙、炎癥、折疊蛋白積累和泛素蛋白酶體系統功能障礙等。其中內質網是蛋白質合成和折疊的場所,其錯誤折疊或合成障礙將誘發內質網應激。為了克服內質網應激,細胞內形成一套特定的信號處理通路,稱為內質網應激反應通路[7]。BIP作為分子伴侶蛋白和內質網應激信號通路的主要調控因子,利用細胞降解機制使未折疊的蛋白質重新折疊或降解。研究發現,包括PERK/Caspase-12激酶通路和ATF6/CHOP通路等都參與BIP介導的內質網應激的發生[8]。隨著高強度或長時間內質網應激可誘導內源性細胞凋亡發生,在此過程中,細胞調動一系列精確機制,來保護細胞內蛋白質的折疊和組裝的動態平衡[9]。

文獻[10]報道,SH-SY5Y細胞系作為神經退行性疾病研究的常用細胞系,主要用于研究帕金森病、阿爾茨海默病等神經退行性疾病的病理機制。本研究顯示,在內質網應激誘導劑TG(1.0 μmol·L-1)處理時間為10 h時,SH-SY5Y細胞活力顯著下降,而1.0 μmol·L-1芹菜素預處理1 h可恢復TG所致SH-SY5Y細胞活力下降,起到保護作用。此外,還發現TG可引起內質網應激相關蛋白BIP、CHOP、Caspase-12表達增多,Bcl-2表達明顯降低,而Bax表達未見明顯改變。研究證實,TG可引起內質網應激,并引起細胞凋亡。

前期研究認為,芹菜素可以抑制淀粉樣蛋白誘導的SH-SY5Y細胞凋亡發生[11],淀粉樣蛋白也可以作為一種內質網應激誘導劑,用于各種神經元細胞模型。筆者發現,在TG誘導的內質網應激中,芹菜素預處理組可以明顯逆轉BIP、CHOP、Caspase-12、Bcl-2蛋白表達以及Bcl-2/Bax比值,但對Bax的作用不明顯。提示芹菜素可能通過抑制TG所致內質網應激發生,阻止細胞凋亡,從而抑制神經細胞損傷。然而,芹菜素抑制內質網應激誘導細胞凋亡通路的具體分子機制仍值得進一步研究。

綜上所述,芹菜素能夠逆轉TG誘導內質網應激,恢復內質網應激所致細胞活力改變,并抑制內質網應激引起的細胞凋亡。本研究為芹菜素治療神經退行性疾病提供了實驗參考。