關節腔注射用雷公藤甲素微球組織分布與代謝*

王麗娟,車坷科,張穩穩,丁永良,姜理華

(1.重慶醫藥高等專科學校藥學院,重慶藥物制劑工程研究中心,重慶 401331;2.重慶市人民醫院藥學部,重慶 400014)

類風濕關節炎(rheumatoid arthritis,RA)是一種發病率高、致殘率高、嚴重影響患者生活質量的慢性全身性自身免疫性疾病,以關節病變引起肢體嚴重畸形,關節滑膜炎及漿膜、心肺、皮膚、眼、血管等結締組織廣泛性炎癥為主要表現,目前認為RA中關節軟骨和骨組織的損害主要由滑膜細胞活化和增生所致[1-2]。雷公藤甲素(triptolide,TPL)是雷公藤主要活性成分之一,低濃度即可抑制滑膜細胞增生,并誘導成纖維滑膜細胞凋亡[3]。雖然雷公藤中藥制劑取得了較好的臨床效果,但毒副作用較多,如胃腸道刺激、生殖系統毒性、皮膚黏膜反應、肝毒性、心律失常、急性中毒等。基于TPL療效好但毒副作用大的特點,筆者所在課題組前期設計并制備了緩釋性能良好的關節腔內注射用TPL微球(TPL microspheres for intra-articular injection,TPL-MS)用于治療RA,該微球可將藥物直接輸送至受累關節,避開藥物體內轉運中的生理屏障,避免或減輕全身不良反應,延長藥物在關節內的維持時間,以較小的劑量發揮最大藥效,但其體內分布與代謝等問題仍有待明確。TPL主要通過細胞色素P450酶(cytochrome P450,CYP450)代謝消除,是TPL的主要解毒途徑之一,肝臟對TPL的代謝能力與其肝毒性有關[4-6]。筆者在本實驗采用超高效液相色譜-串聯質譜(ultra performance liquid chromatography-tandem mass spectro-metry,UPLC-MS/MS)法及高分辨質譜法,考察TPL-MS在大鼠的組織分布和體內外代謝行為,并對可能存在的代謝產物種類進行分析,以期為其應用奠定基礎。

1 材料與方法

1.1實驗動物 SD大鼠,雌雄不限,平均體質量(200±20)g,由重慶醫科大學實驗動物中心提供,實驗動物生產許可證號:SCXK(渝)2018-0003,實驗動物使用許可證號:SYXK(渝)2018-0003。給藥前自由進食飲水,標準飼養條件飼養[溫度(25±1)℃,相對濕度(60±10)%,12 h光照和12 h黑暗交替,標準飼料],動物實驗方案經重慶醫藥高等專科學校學術倫理委員會批準。

1.2藥品與試劑 TPL對照品(中國食品藥品檢定研究院,純度:98.5%,批號:201804),TPL-MS(重慶醫藥高等專科學校制劑工程中心實驗室自制,批號:20200927),還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸[nicotinamide adenine dinucleotide phosphate,NADPH,中科瑞泰(北京)生物科技有限公司,批號:20200501],混合雄性大鼠肝微粒體[肝臟疾病研究(上海)有限公司,20 g·L-1,批號:20200625],甲醇、乙腈、甲酸銨、甲酸為色譜純,其他試劑均為分析純。鹽酸普萘洛爾對照品(propranolol hydrochloride,IS,中國食品藥品檢定研究院,純度:99%,批號:201809)。

1.3儀器 AR2140電子分析天平(瑞士METTLER TOLEDO公司,感量:0.1 mg),Milli-Q Biocel A-10純水機(Millipore公司),ZNCL-GS恒溫水浴磁力攪拌器(河南愛博特科技發展有限公司),AvantiJ-26XP高速冷凍離心機(美國Beckman公司),Coolsafe110-4pro型冷凍干燥機(丹麥Labogene-Scanvac),Agilent 1290 Infinity II超高效液相色譜儀(美國Agilent公司,配二元泵、柱溫箱、自動進樣器、DAD檢測器),Agilent 6460三重四級桿LC/MS(美國Agilent公司),DCY-16S型氮吹儀(昆山廣測儀器設備有限公司),FSH-2型組織勻漿機(江蘇省金壇市宏華儀器廠),GL-88B型旋渦混合器(山東良辰儀器設備有限公司),DW86L628海爾低溫冰箱(海爾集團)。

1.4TPL含量測定方法

1.4.1色譜條件 Agilent ZORBAX SB-C18色譜柱(2.1 mm×100 mm,1.8 μm),流動相A:5 mmol·L-1甲酸銨溶液(含0.1%甲酸),流動相B:純乙腈,梯度洗脫程序:30%B(0～3.7 min),95%B(4.0 min),95%B(4.0～10.0 min),30%B(10.1 min),30%B(10.1～15 min),流速0.4 mL·min-1,柱溫40 ℃,進樣量2 μL。

1.4.2質譜條件 電噴霧離子源(electron spray ionization,ESI),正離子檢測,掃描方式多反應監測(multiple reaction monitoring,MRM),離子源溫度350 ℃,毛細管電壓4 000 V,干燥氣流速10 L·min-1,霧化氣壓力241.3 kPa(35 psi),TPL檢測離子對m/z378.1/361.0,內標IS檢測離子對m/z260.0/116.2。

1.4.3UPLC-MS/MS方法學考察 專屬性:將加入TPL和內標后的心、肝、脾、肺、腎、血漿、關節等組織處理后進樣,觀察雜質與TPL分離情況。肝微粒體酶樣品同法操作。

檢測限和定量限:將各組織或肝微粒體酶樣品分別逐級稀釋至一系列濃度,依次進樣,以信噪比S/N=3：1計算檢測限,以信噪比S/N=10：1計算定量限。

線性關系考察:配制系列濃度TPL對照品溶液,精密量取對照品溶液100 μL,加入空白組織勻漿,配制成系列濃度標準生物樣品,處理后進樣。以TPL峰面積與IS峰面積比值(Y)和藥物質量濃度(X)進行線性回歸。肝微粒體酶樣品同法操作,但高濃度設置與其他生物樣品不同。

相對回收率:配制低、中、高濃度TPL標準生物樣品,處理后進樣。根據回歸方程計算理論濃度,以理論濃度與實際濃度之比計算相對回收率。

精密度和穩定性:配制低、中、高濃度TPL標準生物樣品,處理后進樣,每天進樣5次,計算日內精密度;連續進樣5 d,計算日間精密度;室溫放置8 h后進樣,考察室溫下穩定性;樣品經3次反復凍融,處理后進樣,考察凍融穩定性。

基質效應:取空白組織或血漿,處理后加入TPL與內標,形成低、中、高濃度溶液,測定TPL與內標峰面積比值(A),另用流動相配制上述3種濃度溶液,測定TPL與內標峰面積比值(B),基質效應(%)=A/B×100%。

1.5高分辨質譜測定代謝產物種類方法 采用配備二元泵、在線真空脫氣機、自動進樣器、控溫箱和二級陣列檢測器的UPLC對原藥及代謝物進行分離,采用高分辨質譜(HESI檢測器的thermo Q-exactive質譜儀)測定TPL微球在肝微粒體、肝臟和膽汁中代謝物的準確分子量。C18色譜柱(2.1 mm×100 mm,2.2 μm),流動相條件為0.1%甲酸(10%)和乙腈(90%)等度洗脫。柱溫30 ℃,流速0.2 mL·min-1,進樣體積100 μL。質譜掃描模式為全掃描,母離子掃描范圍為m/z50至m/z750。質譜條件具體如下:毛細管電壓3 800 V,毛細管溫度320 ℃,霧化氣氮氣壓力275.8 kPa(40 psi),離子源溫度350 ℃,Thermo Xcalibur Qual Browser軟件控制儀器和進行數據分析。因代謝物類型不做定量檢測,因此只需要排除內源性物質干擾,不進行方法學考察。

1.6體外代謝實驗方案

1.6.1肝勻漿及肝微粒體中TPL的代謝百分比 實驗分為TPL溶液組(TPL-IN,含8%丙二醇)和TPL-MS組[TPL-MS,微球經質譜測定載藥量為(1.82±0.16)%],每組分別做肝勻漿和肝微粒體酶實驗。

取健康SD大鼠,處死后手術取出肝組織(4 ℃下操作),置冰袋上,用眼科剪剪碎,pH值7.4磷酸緩沖液(phosphate buffered saline,PBS)洗去組織內血液,濾紙吸干,無菌下稱重,按1：4比例加入上述PBS,組織勻漿機制成肝勻漿,測定勻漿液蛋白質濃度(g·L-1)。體外代謝孵育體系總體積250 μL,包括PBS、TPL-IN或TPL-MS(TPL終濃度均為50 μmol·L-1)、肝微粒體(或上述肝勻漿)、NADPH,肝微粒體組和肝勻漿組各設平行樣品3個,蛋白濃度均為1.0 g·L-1。將肝微粒體(或肝勻漿)與TPL-IN(或TPL-MS)的混合溶液、NADPH分別在37 ℃預孵育5 min,將后者加入微球混合溶液中啟動反應,并繼續在37 ℃恒溫振蕩器繼續孵育,于 5、15、30、45、60和120 min從孵育體系中取樣40 μL,加入含內標(終濃度25 ng·L-1)的冰乙腈400 μL終止反應。樣品渦旋振蕩 1 min,15 000 r·min-1離心10 min(r=32.5 cm),取上清液檢測剩余TPL濃度。同時實驗平行設置不加NADPH的空白對照組、零時反應組和加入咪達唑侖的陽性對照組。根據濃度計算不同時間點時剩余TPL的峰面積與初始峰面積比值,以百分含量表示肝勻漿和肝微粒體孵育液中未代謝TPL占初始TPL量的百分比(%)。

1.6.2肝勻漿及肝微粒體中TPL代謝產物種類 取肝勻漿(或肝微粒體),稀釋到蛋白質濃度1.0 g·L-1,加TPL-IN或TPL-MS(TPL終濃度50 μmol·L-1),再加NADPH溶液,最終使孵育體系總體積250 μL,37 ℃水浴振蕩培養。所有孵育體系分別于30 min加入含內標(終濃度25 ng·L-1)的冰乙腈400 μL終止反應。樣品渦旋振蕩 1 min,15 000 r·min-1(r=32.5 cm)離心10 min,取上清液適當濃縮后檢測可能存在的代謝產物。

1.7體內代謝實驗方案 將12只SD大鼠稱重后分為2組,每組6只,第一組關節腔注射TPL-MS(劑量10 mg·kg-1,按微球實際載藥量折算制劑質量),第二組關節腔注射TPL-IN(劑量10 mg·kg-1)。每組取3只收集0-8、8-16、16-24 h糞便和尿液,糞便晾干后研磨混勻,尿液可根據總量多少適當濃縮,不做其他預處理;另外3只于1 h處死,取肝組織,用pH值7.4PBS洗凈血液,擦干水分,-80 ℃冰箱內凍存,同時剝離并剪破膽囊,取膽汁-80 ℃冰箱內凍存。取糞便加4%牛血清白蛋白溶液(1：4,m/V),制成糞便勻漿,乙酸乙酯提取(提取2次,合并提取液),提取液用40 ℃氮氣吹干,500 μL甲醇超聲提取10 min,15 000 r·min-1(r=32.5 cm)離心5 min,取上清液檢測代謝物。取膽汁加乙酸乙酯提取(提取2次,合并提取液),提取液用40 ℃氮氣吹干,500 μL甲醇超聲提取10 min,15 000 r·min-1(r=32.5 cm)離心5 min,取上清液檢測代謝物。尿液處理方法同膽汁。取肝組織,用眼科剪剪成勻漿,取勻漿2.0 g,用乙酸乙酯提取(提取2次,合并提取液),提取液用40 ℃氮氣吹干,500 μL超聲提取10 min,15 000 r·min-1(r=32.5 cm)離心5 min,取上清液檢測代謝物。對不同時間段(0-8、8-16和16-24 h)糞便和尿液中原藥和代謝物檢出情況進行分析。

1.8組織分布測定 取SD大鼠54只,稱重后隨機分成2組: TPL-MS關節腔給藥組(A組,TPL-MS 10 mg·kg-1,按載藥量折算成微球質量);TPL-IN關節腔給藥組(B組,TPL-IN10 mg·kg-1)。A組于給藥后30 min、2 h、8 h、1 d、2 d、3 d、5 d、8 d、12 d取心、肝、脾、肺、腎、給藥側關節等組織(每個時間點處死3只)和全血(交叉取血,每個時間點取3只);B組于給藥后15 min、30 min、1 h、2 h、4 h、8 h、12 h、1 d、2 d取心、肝、脾、肺、腎、給藥側關節等組織(每個時間點處死3只)和全血(交叉取血,每個時間點取3只)。取全血,12 000 r·min-1(r=50.8 cm)離心10 min,分離血漿。給藥側關節取出后,用PBS沖洗,擦干,取全部軟骨滑膜組織,稱重。其他組織用pH值7.4PBS洗凈血液,擦干,稱重。以上血漿和各組織均于-80 ℃冰箱內保存。測試前室溫下解凍,取組織0.1 g(或血漿200 μL),加內標溶液(100 μg·mL-1)50 μL,乙酸乙酯共3 mL分2次渦旋提取TPL,合并提取液后離心[12 000 r·min-1(r=50.8 cm),10 min],取上清液氮氣吹干(40 ℃),甲醇200 μL復溶,用孔徑0.22 μm濾頭過濾后進樣。以內標法計算各組織中TPL濃度(ng·g-1或ng·mL-1)。必要時將樣品適當稀釋后進樣,保證濃度在線性范圍內。

2 結果

2.1UPLC-MS/MS方法學考察結果 大鼠各組織、血漿、肝微粒體質譜圖見圖1,內源性物質不干擾測定,TPL峰(保留時間約3.1 min)和內標IS峰(保留時間約2.4 min),分離度R>1.5。檢測限0.3 ng·mL-1,定量限3 ng·mL-1。各組織標準曲線及線性范圍結果見表1。相對回收率≥87%。日內精密度RSD≤4.69%,日間精密度RSD≤6.14%。室溫放置8 h穩定性RSD≤4.72%,3次反復凍融后穩定性RSD≤4.12%。基質效應≥92.8%。

表1 大鼠組織、器官中TPL標準曲線Tab.1 Standard curves of TPL in rat tissues and organ

A.心;B.肝;C.脾;D.肺;E.腎;F.血漿;G.關節;H.肝微粒體。圖1 大鼠各組織及肝微粒體加入TPL與IS后的UPLC-MS/MS色譜圖 A.heart;B.liver;C.spleen;D.lung;E.kidney;F.plasma;G.joint tissues;H.liver microsome.Fig.1 UPLC-MS/MS chromatograms of TPL and IS in rat tissues and liver microsome

2.2體外代謝百分比 肝勻漿及肝微粒體TPL代謝百分比結果見表2。由表2可知,2種制劑在肝勻漿和肝微粒體中隨著時間延長不斷被代謝,30 min時TPL-IN在肝勻漿和肝微粒體中分別下降50.32%和49.47%,TPL-MS在肝勻漿和肝微粒體中分別下降47.62%和46.39%,2種制劑體外代謝規律基本一致,差異無統計學意義。

表2 2種制劑在大鼠肝勻漿與肝微粒體中代謝百分比Tab.2 The percentage of TPL metabolism in rat liver homogenate and liver microsome

2.3體內外代謝物種類分析 體內外代謝研究中共觀察到TPL原藥及其4種代謝物,質荷比分別為m/z361.1646(原藥,[M+H]),m/z377.159 5(代謝物,[M1+H]),m/z377.159 5(代謝物,[M2+H]),m/z391.138 7(代謝物,[M3+H])和m/z391.138 7(代謝物,[M4+H]),保留時間分別是11.4～11.7,7.9～8.4,10.0～10.4,3.4～4.3和7.1～8.2 min,代謝物保留時間均早于原藥,可能由于代謝物主要是羥基化產物,極性較原藥大。M-M4的提取離子流圖譜和二級質譜圖見圖2。實驗發現,TPL可以轉化為m/z359.148 9(TPL,[M-H]);M1和M2除了有[M1/M2+H]峰外,均可以轉化為m/z375.143 8(代謝物脫氫,[M1/M2-H]);M3和M4除了有[M3/M4+H]峰外,均可以轉化為m/z389.124 4(代謝物脫氫,[M3/M4-H])。這可能由全離子掃描模式造成,因此需要結合保留時間進行評價,以驗證是否為代謝物。

A.TPL;B.M1;C.M2;D.M3;E.M4。圖2 TPL及其代謝物M1-M4提取離子流與二級質譜圖 A.TPL;B.M1;C.M2;D.M3;E.M4.Fig.2 Extraction ion flow diagrams and secondary mass spectrograms of TPL and its metabolites M1-M4

TPL-IN與TPL-MS在肝勻漿、肝微粒體、體內肝臟、膽汁、糞便和尿液中的具體代謝物種類分布結果見表3。由表3可知,大鼠體內肝臟發現原藥及代謝物3種,M4未發現;膽汁中僅發現原藥與M2,可能由于濃度較低;尿液中發現原藥及代謝物M1、M2和M3,糞便中發現原藥及單羥基代謝物M1與M2。TPL-IN與TPL-MS代謝產物結果顯示,2種劑型代謝途徑和代謝物種類相似,劑型變化未改變TPL代謝途徑和代謝物種類。

表3 TPL-IN與TPL-MS在體內外的代謝物Tab.3 Metabolites of TPL-IN and TPL-MS in vivo and in vitro

2.4體內代謝速度分析 大鼠糞便及尿液代謝物檢出情況見表4。結果顯示,TPL經肝臟代謝后主要經尿液排出,TPL-IN組主要代謝時間集中在給藥后8 h,8-16和16-24 h代謝物基本檢測不出來,TPL-MS組可在0-8、8-16和16-24 h尿液中持續檢出代謝物,表明TPL-MS改變了體內釋放速度。

表4 大鼠糞便及尿液中TPL原藥及代謝產物在不同時間段檢出情況Tab.4 Detection of TPL and its metabolites in feces and urine of rats at different time periods

2.5體內組織分布情況 各組數據結果見表5。結果顯示,關節腔注射給藥后,關節組織藥物濃度均較血漿及其他組織高,說明關節腔給藥有一定局部靶向作用。但與TPL-IN組相比,TPL-MS組TPL在關節組織滯留時間更持久,第3天達到最高濃度[(243.79±14.12)ng·g-1],在關節組織內維持時間近2周,長時間緩釋作用更強。而TPL-IN組注射后即刻達到最高濃度[15 min關節組織濃度(278.29±12.65)ng·g-1],此后逐漸下降,48 h后TPL濃度很低。除關節外的其他組織(心、肝、脾、肺、腎、血漿),TPL-MS組也是在第3天才達到最高濃度。從各組織內最高點藥物濃度數據看,TPL-MS組較TPL-IN組有所降低,TPL-MS組心、肝、脾、肺、腎、血漿最高藥物濃度為(20.08±1.17)、(23.39±1.97)、(23.65±1.76)、(18.78±1.32)、(16.81±1.67) ng·g-1和(18.86±1.47)ng·mL-1;TPL-IN組分別為(29.65±1.59)、(34.12±2.57)、(28.37±2.75)、(26.49±3.21)、(30.39±2.81) ng·g-1和(21.03±1.86)ng·mL-1。TPL被制備成微球后,能較長時間停留在關節組織,進一步減少關節腔給藥次數,降低除關節之外其他組織血藥濃度峰值,緩釋效果較溶液劑型有明顯提高,有利于藥物發揮治療效果,且降低全身毒副作用。

表5 關節腔注射TPL-MS或TPL-IN后TPL在組織中的分布Tab.5 Distribution of TPL in tissues following intra-articular administration of TPL-MS or TPL-IN

3 討論

筆者所在課題組制備的TPL-MS形態圓整[7-8],大小均一,平均粒徑約5 μm,平均載藥量約2%,體外釋放研究顯示TPL-MS第1天處于突釋階段,累積釋放率超過30%,此后進入緩釋階段,到第10天總累積釋放率超過60%。筆者在本實驗采用的TPL-MS平均粒徑4.75 μm,載藥量(1.82±0.16)%。

文獻報道TPL在大鼠和人體內的主要代謝物是單羥基和雙羥基代謝物[9-10]。本研究發現4種代謝物,其中M1和M2是單羥基TPL代謝物,可能是一對同分異構體,M3和M4是TPL的單羥基和單羰基代謝物,也可能是一對同分異構體。體外肝勻漿和肝微粒體酶中發現了原藥及其4種代謝物M1-M4,較體內發現的代謝物種類(M1-M3)多,可能由于代謝產物在體外孵育體系中不斷蓄積,濃度較高。而體內代謝是一個連續的過程,代謝產物隨尿液和糞便不斷排出體外,含量較低。與文獻報道的代謝物類型相比,筆者在本實驗并沒有檢測到新的代謝物;TPL-MS與TPL-IN相比,代謝物種類一致。說明使用TPL-MS不會引入新代謝物,安全性較好。

組織分布結果顯示,關節腔注射微球劑型和溶液劑型后呈現完全不同的分布行為。在關節組織中,TPL-IN組在15 min即達最高濃度,2 d后TPL從關節腔內完全消除,說明溶液劑型在關節腔內滯留時間有限;TPL-MS組達峰濃度出現在給藥后第3天,直至第12天仍有釋放,說明微球劑型在關節腔內形成了藥物儲庫,逐漸釋放藥物。從心、肝、脾、肺、腎和血漿的數據看,TPL-MS組在各監測點的濃度較TPL-IN組均有不同程度降低,說明長期用藥時微球能降低藥物在非靶器官的積累,減少毒副作用。

研究表明,TPL劑量越大毒性越大[11],改變劑型和給藥方式是重要的減毒手段之一,如TPL自乳化給藥系統[12]可減輕肝臟毒性;TPL腎靶向納米粒[13]可減輕肝毒性、生殖毒性和免疫毒性。筆者在本實驗中將TPL制成TPL-MS,并采用UPLC聯合高分辨質譜[14]對不同時間段糞便和尿液中原藥和代謝物的出現時間、離子豐度進行比較分析。結果顯示,TPL-IN組代謝物濃度在0～8 h達到峰濃度,而TPL-MS組代謝物濃度在16～24 h達到峰濃度,表明TPL被包裹成微球進行關節腔注射后,在肝臟被代謝轉化的時間被延遲,間接證實TPL-MS可延緩藥物體內釋放過程,擴大TPL治療窗,改善用藥安全問題,這與組織分布測得的結果一致。

綜上所述,TPL-IN與TPL-MS 2種制劑在肝勻漿和肝微粒體孵育實驗中,含量均隨著時間延長而顯著降低,兩者體外代謝規律基本一致。在體內外代謝研究中共尋找到TPL原藥及其4種代謝物,2種制劑代謝途徑和代謝物種類相似,但代謝速度有差異。TPL-MS在關節腔內滯留時間較溶液制劑長,微球對藥物的包裹能明顯延緩藥物在體內分布和代謝行為,證實了TPL-MS在臨床實踐中延長藥物釋放的可行性。