SARS-CoV-2的RT-RAA快速檢測方法建立與應用

章文,艾樂樂,譚偉龍,馮茜,錢宇清,薛松△（.江蘇省第二中醫院,江蘇 南京 0000;.東部戰區疾病預防控制中心,江蘇 南京 0000）

冠狀病毒（coronavirus，CoVs）是一種有包膜、非節段的單股正鏈RNA病毒，屬于巢病毒目冠狀病毒科正冠狀病毒亞科。該亞科由α冠狀病毒屬、β冠狀病毒屬、γ冠狀病毒屬和δ冠狀病毒屬共四個屬組成[1]。目前主要采用qPCR方法對病毒核酸進行檢測和定量，該方法具有高度的靈敏度和特異性[2]。自COVID-19暴發以來，許多實時qPCR（RT-qPCR）檢測試劑被開發出來，并且用于SARS-CoV-2的實驗室檢測[3]。但qPCR的檢測需要專業的人員和較精密的實驗設備，且檢測時間至少需要1.5小時[4-6]。由于SARS-CoV-2疫情在全球范圍內流行，出現了大量患者、無癥狀感染者和密切接觸者，如何更加快速、準確檢測SARSCoV-2對疫情防控至關重要。本研究建立單管逆轉錄重組酶介導擴增（Reverse transcription recombinase aided amplification，RTRAA）方法，檢測SARS-CoV-2核衣殼（N）基因。運用商用RTqPCR試劑和RT-RAA方法對127人份臨床咽拭子樣本進行檢測，檢測結果一致性達100%。本研究建立的RT-RAA法檢測SARSCoV-2，具有快速、靈敏、操作簡單及設備要求低等特點，對于當前疫情下快速檢測SARS-CoV-2具有重要作用。

1 材料與方法

1.1 引物和探針設計 在NCBI數據庫中下載20條SARS-CoV-2核酸序列，使用DNAMAN7.0軟件對序列進行比對。在目標ORF1ab基因中發現一個保守區（GenBank：MT559038.1，position 3111-3406），根據這個區域設計RT-RAA引物和探針，引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.2 RT-RAA方法建立 使用RT-RAA核酸擴增試劑盒（熒光法）（江蘇奇天基因生物科技有限公司，中國）進行建立檢測方法。反應體系共50μL，其中，純化水，13μL；緩沖液Ⅵ，25μL；正向引物（10μM），2μL；反向引物（10μM），2μL；探針，0.5μL；DNA模板，5μL；乙酸鎂，2.5μL。按照上述反應體系（除模板DNA和乙酸鎂外）配置混合液，將混合液手彈混勻短暫離心，加入42.5μL混合液至熒光基礎反應單元中，輕柔手彈，使凍干粉充分重溶均勻，短暫離心將液體收集至管底，然后于每個反應單元管蓋上加入2.5μL乙酸鎂溶液，之后向各反應單元中加入模板DNA或陰性質控品，充分混勻并離心。而后再將反應單元轉移到QT-RAA-F1620儀器（江蘇奇天基因生物科技有限公司，中國）中，擴增條件設定在39℃，反應時間30分鐘。

1.3 RNA提取 使用病毒核酸提取試劑盒（TAKARA，大連，中國）提取106名疑似COVID-19患者的咽拭子樣本中的病毒核酸。取200ul咽拭子病毒液，經過病毒裂解，核酸提取，用40ul RNase free dH2O洗脫后，放入-80℃冰箱保存備用。

1.4 靈敏度實驗 委托上海生工合成序列CTGCTCTTCAACCTGAA GAAGAGCAAGAAGAAGATTGGTTAGATGATGATAGTCAACAAA CTGTTGGTCAACAAGACGGCAGTGAGGACAATCAGACAACTAC TATTCAAACAATTGTTGAGGTTCAACCTCAATTAGAGATGGAAC TTACACCAGTTGTTCAGACTATTGAAGTGAATAGTTTTAGTGGTT ATTTAAAACTTACTGACAATGTATACATTAAA AATGCAGACATTGTGGAAGAAGCTAAAAAGG TAAAACCAACAGTGGTTGTTAATGCAGCCAA TGTTTACCTT構建含新型冠狀病毒基因序列質粒，載體：PUC57；載體大小：2710bp；克隆位點：SmaI；宿主菌：DH5α；抗性：氨芐。拷貝數（拷貝/μL）=｛[6.02×1023]×[質粒濃度（ng/μL）×10-9]｝/[DNA長度×660]）。將質粒梯度稀釋為106、105、104、103、102、101、100拷貝/μl 7個濃度，依次對上述定量樣品利用RT-RAA反應擴增體系進行測定，評價檢測方法的靈敏度。將ORF1ab基因的一段保守序列（GenBank: MT559038.1，position 3111-3406）構建到質粒上，載體：PUC57；載體大小：2710bp；克隆位點：SmaI；宿主菌：DH5α；抗性：氨芐。

1.5 特異性實驗 選用5種呼吸道病毒對本實驗的特異性進行驗證。用腺病毒3型、7型、55型，甲型流感病毒（2009H1N1，H3N2）和陽性樣本核酸作為模板，評價RT-RAA方法的特異性。5種呼吸道病毒核酸在本實驗室保存。

1.6 兩種方法對臨床樣本檢測 收集了106名新型冠狀病毒患者和疑似人員的咽拭子，所有樣本均由專業人員在P2實驗室中進行核酸的提取和檢測，提取的核酸樣本用RT-RAA和商用RT-qPCR兩種方法進行檢測。

2 結果

2.1 靈敏度檢測 以梯度稀釋106-100copies/μl的7個RNA樣本為模板，驗證RT-RAA方法的檢測靈敏度。結果顯示該方法在模板濃度為106-101copies/μl時，均表現出良好的擴增曲線，100copy/μl時無擴增曲線。該檢測方法的最低檢測濃度為10copies/μl。當模板濃度大于103copies/μl時，反應在第10分鐘時就表現出良好的擴增曲線。見圖1。

圖1 RT-RAA檢測方法靈敏度檢測

2.2 特異性檢測 特異性檢測結果顯示，陽性對照和陽性樣本均表現出良好的擴增曲線，腺病毒3型、7型、55型，甲型流感病毒（2009H1N1，H3N2）和陰性對照均無擴增曲線。由此可知該檢測方法表現出良好的特異性。見圖2。

圖2 RT-RAA檢測方法特異性檢測

2.3 臨床樣本的檢測 使用商用RT-qPCR和RT-RAA檢測方法對106名COVID-19患者和疑似感染者的臨床咽拭子樣本進行檢測，32個陽性和74個陰性樣本用這兩種檢測方法結果一致，說明該RT-RAA檢測方法具有良好的穩定性，適合推廣應用。

3 討論

據報道，SARS-CoV-2主要通過飛沫傳播，人感染SARSCoV-2并出現癥狀后，鼻咽部的病毒載量更高[7]。早期發現、早期隔離和治療對防止病毒傳播和臨床治療具有重要意義。目前對COVID-19的診斷主要依靠RT-qPCR的方法，中國衛生機構通過大量的RT-qPCR檢測，精準定位傳染源，采取有效的隔離措施，最終國內COVID-19已得到遏制，但其在全球其他國家仍在迅速傳播。由于RT-qPCR方法需要精密的儀器設備、專業的操作人員和較長的檢測時間，許多不發達國家很難進行大規模檢測。RT-RAA方法具有操作簡單、檢測用時短和高靈敏度等特點，這對SARS-CoV-2感染的早期診斷和及時采取衛生措施具有重要意義[8]。

本實驗建立的SARS-CoV-2的RT-RAA方法，采用重組酶介導的等溫擴增法檢測SARS-CoV-2核酸。該方法利用重組酶能夠在常溫下實現DNA解鏈并快速進行擴增，不依賴精密設備、反應快速。該方法所使用的RAA熒光檢測儀體積較小，便于攜帶，只需提供39℃等溫環境，電量消耗小，使用鋰電池即可運行，適用于現場快速檢測。當檢測核酸濃度大于103copies/ul時，可在10分鐘內檢測出陽性樣本。該方法的靈敏度可達到10copies/ul，與RT-qPCR的檢測靈敏度接近。運用該方法檢測5種呼吸道病毒和SARS-CoV-2陽性樣本，只有陽性樣本出現擴增曲線，其他5種呼吸道病毒均未出現擴增曲線，表現出良好的特異性。使用RTRAA和商用RT-qPCR方法對106名COVID-19患者和疑似感染者咽拭子樣本進行檢測，兩種方法的一致性為100%，表現出良好的穩定性，該種方法的檢測結果值得信賴。

本研究建立的RT-RAA檢測方法較現有的RT-qPCR方法具有操作簡單、檢測時間短、靈敏度高、特異性強等特點，為COVID-19疫情的快速診斷提供了準確可靠的檢測技術，為此次疫情提供了更加低成本的檢測方法。