基于代謝組學(xué)技術(shù)探討腎陽方治療骨質(zhì)疏松癥腎陽虛證的作用機制

黃晨,施杞,王擁軍,唐德志

(上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬龍華醫(yī)院,上海 200032)

骨質(zhì)疏松癥(osteoporosis,OP)是一種常見的代謝性骨病,其特征為骨量減少和骨組織微結(jié)構(gòu)損壞,導(dǎo)致骨脆性增加、易于發(fā)生骨折[1-2]。隨著人口老齡化問題日益嚴重,OP已成為我國50歲以上人群的重要健康問題[3-4]。國醫(yī)大師施杞教授以腎陽方為基礎(chǔ)方治療OP腎陽虛證,臨床療效較為理想,但其作用機制尚不明確。代謝組學(xué)是對細胞內(nèi)源性和外源性代謝產(chǎn)物進行定量鑒定和定性分析,以揭示生物代謝產(chǎn)物的代謝途徑與觀察到的生理和/或病理變化之間的相對關(guān)系的方法,已被廣泛應(yīng)用于生物標志物檢測、藥物療效監(jiān)測和發(fā)病機制研究[5]。本研究采用代謝組學(xué)技術(shù)探討了腎陽方治療OP腎陽虛證的作用機制,現(xiàn)總結(jié)報告如下。

1 材料與儀器

1.1 實驗動物2月齡雌性SD大鼠30只,體質(zhì)量(200±10)g,實驗動物合格證號:SCXK(京)2019-0010。大鼠在上海中醫(yī)藥大學(xué)動物房飼養(yǎng),自由飲水、進食。實驗方案經(jīng)上海中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物倫理委員會審查通過,倫理批件號:PZSHUTCM210625007。

1.2 藥品及試劑腎陽方,藥物組成包括肉蓯蓉 12 g、淫羊藿9 g、骨碎補9 g,所有中藥飲片均購自上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬龍華醫(yī)院中藥房。向中藥飲片中加入飲片質(zhì)量12倍量水,浸泡30 min,煎煮30 min后趁熱過濾,濾渣再加入12倍量水,煎煮30 min后趁熱過濾,合并2次濾液,濃縮至1.03 g·mL-1。氫化可的松注射液(天津金耀藥業(yè)有限公司),雌二醇(estradiol,E2)ELISA測試盒、環(huán)磷酸腺苷(cyclic adenosine monophosphate,cAMP)ELISA測試盒、環(huán)磷酸鳥苷(cyclic guanosine monophosphate,cGMP)ELISA測試盒、Ⅰ型膠原C末端肽(C-telopeptide of type Ⅰ collagen,CTX-Ⅰ)ELISA測試盒、骨鈣素(osteocalcin,OCN)ELISA測試盒(南京建成生物工程研究所),MxP?Quant 500靶向代謝組學(xué)試劑盒(Biocrates公司)。

1.3 實驗儀器vivaCT80 Micro-CT(Scanco公司),紫外分光光度計(Beckman Coulter公司),QTRAP 6500+液相質(zhì)譜聯(lián)用儀(SCIEX公司)。

2 方 法

2.1 動物分組將30只大鼠稱重后按體質(zhì)量排序編號,從隨機數(shù)字表中選取30個連續(xù)2位數(shù)記錄在大鼠編號下方,再將30個隨機數(shù)字從小到大排序,隨機數(shù)字排序1～10對應(yīng)的大鼠納入對照組、11～20對應(yīng)的大鼠納入模型組、21～30對應(yīng)的大鼠納入為腎陽方組。

2.2 造模及干預(yù)禁食不禁水12 h后,采用3%戊巴比妥鈉按1 mL·kg-1腹腔注射麻醉,對照組大鼠從雙側(cè)卵巢附近切除少量脂肪組織,其余2組大鼠按照文獻[6]中的方法摘除雙側(cè)卵巢。造模手術(shù)1個月后,模型組和腎陽方組大鼠按照20 mg·kg-1皮下注射氫化可的松注射液(5 mg·mL-1)進行腎陽虛證造模,每天1次,連續(xù)注射14 d[7-9]。造模結(jié)束后,腎陽方組按生藥5.14 g·kg-1·d-1以腎陽方藥液灌胃,其余2組均以等量生理鹽水灌胃,連續(xù)干預(yù)60 d。

2.3 實驗指標檢測

2.3.1一般情況觀察 藥物干預(yù)結(jié)束后,觀察各組大鼠外觀、精神狀況及活動情況。

2.3.2血清指標檢測 觀察結(jié)束后腹腔注射戊巴比妥鈉麻醉大鼠,先經(jīng)腹主動脈取血,再脫頸處死大鼠。分離血清,取部分血清采用ELISA法檢測E2、cAMP、cGMP、OCN、CTX-Ⅰ含量,具體操作按照測試盒說明書進行。

2.3.3骨密度及骨組織微結(jié)構(gòu)檢測 采用vivaCT80 Micro-CT對所有大鼠的L4進行三維掃描,獲得重建圖像后進行定量分析,獲取骨密度、骨體積分數(shù)、骨小梁數(shù)目、骨小梁厚度、骨小梁分離度。

2.3.4血清代謝組學(xué)分析 采用超高效液相色譜-質(zhì)譜法對各組大鼠的血清進行代謝組學(xué)分析。平臺為QTRAP 6500+液相質(zhì)譜聯(lián)用儀,試劑盒選用MxP?Quant 500靶向代謝組學(xué)試劑盒。使用SCIEX Analyst軟件對代謝組學(xué)數(shù)據(jù)進行量化,并將數(shù)據(jù)導(dǎo)入MetIDQ軟件一步處理。數(shù)據(jù)歸一化、標準化處理后進行偏最小二乘判別分析(partial least squares discriminant analysis,PLS-DA),根據(jù)差異倍數(shù)繪制火山圖,結(jié)合PLS-DA模型變量重要性投影≥1、差異倍數(shù)≥1.2或≤0.833、P<0.05(t檢驗)篩選差異代謝物,并對其進行KEGG通路富集分析。

2.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計采用SPSS25.0軟件進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析。3組大鼠E2血清含量、cAMP血清含量、cGMP血清含量、cAMP/cGMP、OCN血清含量、CTX-Ⅰ血清含量、骨密度、骨體積分數(shù)、骨小梁數(shù)目、骨小梁厚度、骨小梁分離度的組間總體比較均采用單因素方差分析,組間兩兩比較均采用LSD-t檢驗。檢驗水準α=0.05。

3 結(jié) 果

3.1 一般情況觀察結(jié)果與對照組相比,模型組大鼠出現(xiàn)腳趾和耳朵顏色變淡、泛白,體毛顏色暗淡、發(fā)黃、枯萎、粗糙,精神萎靡,活動減少,抓取抵抗性降低,喜扎堆等腎陽虛證表現(xiàn);腎陽方組大鼠上述表現(xiàn)較模型組明顯改善(圖1)。

圖1 3組大鼠藥物干預(yù)結(jié)束后外觀圖

3.2 血清指標檢測結(jié)果3組大鼠E2血清含量、cAMP血清含量、cAMP/cGMP、OCN血清含量、CTX-Ⅰ血清含量比較,組間差異均有統(tǒng)計學(xué)意義;3組大鼠cGMP血清含量的差異無統(tǒng)計學(xué)意義。對照組和腎陽方大鼠的E2血清含量、cAMP血清含量、cAMP/cGMP、OCN血清含量均高于模型組(P=0.000,P=0.002;P=0.001,P=0.014;P=0.000,P=0.012;P=0.004,P=0.008),CTX-Ⅰ血清含量均低于模型組(P=0.000,P=0.013)。見表1。

表1 3組大鼠血清指標檢測結(jié)果

3.3 骨密度和骨組織微結(jié)構(gòu)檢測結(jié)果3組大鼠骨密度、骨體積分數(shù)、骨小梁數(shù)目、骨小梁厚度、骨小梁分離度比較,組間差異均有統(tǒng)計學(xué)意義。對照組和腎陽方組的骨密度、骨體積分數(shù)、骨小梁數(shù)目均高于模型組(骨密度:P=0.000,P=0.007;骨體積分數(shù):P=0.000,P=0.012;骨小梁數(shù)目:P=0.000,P=0.023),骨小梁分離度均低于模型組(P=0.000,P=0.006);對照組的骨小梁厚度大于模型組(P=0.006),腎陽方組和模型組骨小梁厚度的差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.068)。見圖2、表2。

表2 3組大鼠骨密度和骨微結(jié)構(gòu)檢測結(jié)果

圖2 3組大鼠L4 Micro-CT三維掃描圖

3.4 血清代謝組學(xué)分析結(jié)果

3.4.1PLS-DA結(jié)果 對照組和模型組、腎陽方組和模型組的代謝物均能明顯分離,表明OP腎陽虛證大鼠的血清代謝物輪廓發(fā)生了改變,腎陽方治療能夠改變這種代謝物的輪廓(圖3)。

Con為對照組,Mod為模型組,Tre為腎陽方組;橫坐標Component 1、縱坐標Component 2分別表示第一主成分、第二主成分。圖3 3組大鼠血清代謝物偏最小二乘判別分析二維得分圖

3.4.2差異代謝物篩選結(jié)果 模型組較對照組有21個代謝物上調(diào)、7個代謝物下調(diào),腎陽方組較模型組有89個代謝物上調(diào)、9個代謝物下調(diào)(圖4)。這些差異代謝物中13個為氨基酸或與氨基酸有關(guān),93個為膽固醇酯、鞘磷脂、甘油二酯、甘油三酯等脂質(zhì)代謝物。模型組較對照組CE(15∶0)濃度上升、TG(16∶0_37∶3)濃度下降,腎陽方組較模型組CE(15∶0)濃度下降、TG(16∶0_37∶3)濃度上升。

每個圓點代表1個代謝物,灰色表示差異無統(tǒng)計學(xué)意義,藍色表示下調(diào),紅色表示上調(diào),顏色越深表示差異越顯著。圖4 3組大鼠差異代謝物篩選火山圖

3.4.3差異代謝物通路分析結(jié)果 KEGG通路富集分析結(jié)果顯示,對照組和模型組差異代謝物的信號通路有氨酰tRNA生物合成、谷胱甘肽代謝、氨基乙酸-絲氨酸-蘇氨酸代謝、苯丙氨酸-酪氨酸-色氨酸生物合成、纈氨酸-亮氨酸-異亮氨酸生物合成、泛醌和其它萜類-醌生物合成、苯丙氨酸代謝、組氨酸代謝、β-丙氨酸代謝、卟啉和葉綠素代謝、二羧酸代謝、精氨酸和脯氨酸代謝、酪氨酸代謝、初級膽汁酸生物合成,腎陽方組和模型組差異代謝物的信號通路有氨酰tRNA生物合成、生物素代謝、精氨酸生物合成、硒代謝、賴氨酸降解、丙氨酸-天冬氨酸-谷氨酸代謝、半胱氨酸和蛋氨酸代謝(圖5)。

圖5 3組大鼠差異代謝物KEGG代謝通路富集結(jié)果圖

4 討 論

cAMP、cGMP血清含量及其比值被認為是診斷腎虛證的客觀指標,大部分腎陽虛證患者cAMP/cGMP比值均會明顯降低[10-11]。本研究通過去卵巢結(jié)合皮下注射氫化可的松建立OP腎陽虛證模型。大鼠一般情況、血清指標及骨密度及骨組織微結(jié)構(gòu)檢測結(jié)果的變化提示,本研究中OP腎陽虛證模型造模成功。

目前針對OP腎陽虛證的代謝組學(xué)研究較少,而且結(jié)果不盡相同。郭勝男等[12]篩選出的原發(fā)性O(shè)P腎陽虛證患者血清特征性代謝物共221個,包括γ-氨基丁酸、L-異亮氨酸、谷氨酸等,這些差異代謝物參與的信號通路有色氨酸代謝、谷胱甘肽代謝、精氨酸和脯氨酸代謝等。朱庭辰[13]的研究發(fā)現(xiàn),與原發(fā)性O(shè)P腎陽虛證有關(guān)的2個代謝標志物為L-苯丙氨酸和s-乳糖谷胱甘肽。本研究結(jié)果顯示,模型組較對照組有21個代謝物上調(diào)、7個代謝物下調(diào),腎陽方組較模型組有89個代謝物上調(diào)、9個代謝物下調(diào)。這些差異代謝物中13個為氨基酸或與氨基酸有關(guān),93個為脂質(zhì)代謝物。

本研究結(jié)果顯示,氨酰tRNA生物合成通路為模型組與對照組,模型組與腎陽方組差異代謝物富集的共同代謝通路。氨基酸需要被氨酰tRNA合成酶催化,并與其對應(yīng)的tRNA結(jié)合形成氨酰tRNA才能參與到蛋白質(zhì)合成過程中[14]。因此,我們認為OP腎陽虛證模型大鼠體內(nèi)氨基酸合成發(fā)生變化可能會影響蛋白質(zhì)合成,從而對骨健康產(chǎn)生負面影響。谷胱甘肽代謝和精氨酸生物合成分別是對照組與模型組、腎陽方組與模型組代謝差異物富集到的差異最明顯且與骨代謝有關(guān)的通路。谷胱甘肽是一種由半胱氨酸、甘氨酸、谷氨酸組成的小分子肽,具有抗氧化作用和整合解毒作用。谷胱甘肽有還原型和氧化型2種形式,生理條件下機體內(nèi)存在的谷胱甘肽以還原型為主。研究表明,還原型谷胱甘肽可以促進高糖環(huán)境下成骨細胞的增殖、分化[15-16]。代志鵬[17]的研究表明,谷胱甘肽可以通過降低細胞內(nèi)活性氧的水平抑制人骨髓間充質(zhì)干細胞成脂分化,增強成骨分化。Jiang等[18]的研究表明,口服精氨酸可以促進大鼠長骨的線性生長,認為這可能與精氨酸調(diào)控神經(jīng)元型一氧化氮合酶-一氧化氮合酶(nitric oxide synthase,NOS)-鳥苷酸環(huán)化酶-cGMP通路,使下丘腦生長抑素基因表達下調(diào)、垂體生長激素基因表達上調(diào)、垂體生長激素分泌增多有關(guān)。張世旭等[19]的研究顯示,腹腔注射左旋精氨酸能提高骨質(zhì)疏松性骨折大鼠血清NO及NOS濃度,提高骨質(zhì)疏松性骨折大鼠的骨痂骨密度和腰椎骨密度。鎬英杰等[20]的研究表明,左旋精氨酸能上調(diào)成骨細胞中護骨素蛋白的表達,認為這可能是通過激活內(nèi)皮型NOS和誘生型NOS實現(xiàn)的。

以往的研究發(fā)現(xiàn),甘油三酯葡萄糖指數(shù)是OP的獨立影響因素,可作為鑒別OP的客觀指標[21];不飽和脂肪酸對防治OP有積極作用[22];富含不飽和脂肪酸的羅非魚魚頭脂質(zhì)可以通過調(diào)整腸道菌群、下調(diào)5-羥色胺表達等方式延緩OP病情進展[23];骨髓微環(huán)境中的脂肪酸可以觸發(fā)多種信號通路,直接或間接對OP產(chǎn)生有益或者有害的影響[24]。這些研究表明,脂質(zhì)代謝與骨代謝有關(guān)。

本研究的結(jié)果提示,OP腎陽虛證的發(fā)生可能與氨基酸、脂質(zhì)代謝紊亂有關(guān),腎陽方治療可以糾正部分氨基酸、脂質(zhì)代謝紊亂,從而治療OP腎陽虛證。本研究篩選出的與OP腎陽虛證有關(guān)的生物標志物中,大量脂質(zhì)分子的作用目前尚不清楚,也無法匹配信號通路,因此脂質(zhì)代謝與OP腎陽虛證的關(guān)系還有待進一步研究。