Bcl-2蛋白家族調控細胞凋亡機制及其在創面修復中的應用研究進展*

唐 婷,韋柳葉,黃金梅 綜述,唐乾利 審校

(1.廣西中醫藥大學研究生院,南寧 530000;2.右江民族醫學院/桂西高發病防治重點實驗室,廣西百色 533000)

創面愈合是不利因素對機體造成的局部或大面積組織細胞損傷時出現的一種先天自適應性防御反應,由多種信號相關通路及相關蛋白、因子相互作用。其中內在和外在因素影響而愈合遲緩、中斷或停滯的非癌性創面被國際傷口感染協會(International Wound Infection Institute,IWII)稱為慢性創面。慢性難愈合創面具有病因復雜、并發癥多、病程長、復發率高等特點[1-2]。近年來有研究發現,由基因控制的細胞自主有序的程序性死亡過程,即細胞凋亡,可及時清除體內多余的細胞及受損細胞,調節機體正常發育和生命活動,在創面愈合過程中起著關鍵作用[3],且細胞凋亡的各種信號轉導途徑有一個共同的通路交匯點,而該交匯點受B細胞淋巴瘤-2(B cell lymphoma-2,Bcl-2)家族蛋白調節。另有學者研究指出,可通過調節Bcl-2家族蛋白中凋亡抑制因子與凋亡誘導因子的比例抑制細胞凋亡,從而達到促進創面愈合的目的。本文對Bcl-2家族蛋白在細胞凋亡中的調控機制及其在創面修復中的應用研究進展進行了綜述,以期為Bcl-2家族蛋白在慢性難愈性創面治療中的應用提供參考。

1 Bcl-2家族蛋白

1.1 Bcl-2家族蛋白概述

1984年,Bcl-2基因被首次在人類B細胞淋巴瘤的第14號和第18號染色體易位斷裂點t(14,18)上分離獲得[4],且研究發現染色體易位使14號染色體上免疫球蛋白重鏈基因與Bcl-2基因異常融合形成的并列式頭尾結構可導致Bcl-2蛋白過度表達。1986年,有學者[5-6]成功克隆出Bcl-2轉錄的cDNA序列,并從其堿基序列中衍生出Aa序列。1988年,REED等[7]研究發現,Bcl-2基因具有潛在致癌性,并確認其是一種原癌基因。此后大量研究發現,Bcl-2基因的編碼產物Bcl-2蛋白是細胞內完整的膜蛋白,具有抗凋亡特性,能夠抑制線粒體活性氧產生,與細胞程序性死亡密切相關,為后續研究Bcl-2蛋白與線粒體相關的細胞程序性死亡奠定了基礎[8]。另外,自Bcl-2被發現以來,又陸續發現了Bcl-xL、Bcl-2相關X蛋白基因(Bcl-2 associated X protein gene,Bax)等與Bcl-2高度同源的其他分子,它們具有與Bcl-2相似的成孔細菌毒素結構域,且具有人工合成膜形成離子通道的能力,為Bcl-2的后續研究指明了新的方向[9-10]。

1.2 Bcl-2結構與分類

Bcl-2基因存在于線粒體外膜、內質網膜和核膜上,相對分子質量為26×103,全長約250 kb,由3個外顯子和2個啟動子組成,能夠被染色體易位機制激活,可編碼Bcl-2α和Bcl-2β兩種蛋白,其中Bcl-2α是抗凋亡作用的主要蛋白,可由p53、激活蛋白-1(activator protein 1,AP-1)、核因子-κB(nuclear factor-κB,NF-κB)、活化T細胞核內因子(nuclear factor of activated T-cells,NFAT)和環腺苷酸應答元件(cAMP response element,CRE)等多種轉錄因子觸發。

截至目前,已經發現27種Bcl-2家族同源蛋白,并根據結構和功能將其分為兩類:一類是Bcl-2折疊蛋白,包括Bcl-2、Bcl-xL、Bcl-w、骨髓細胞白血病蛋白-1(myeloid cell leukemia-1,Mcl-1)、Bfl-1/A1、Bcl-B共6種抗凋亡蛋白及Bcl相關蛋白Bax、Bak、Bok共3種促凋亡蛋白;另一類是促凋亡“BH3-only”蛋白,包括Bim、Bad、Bmf、Bid、Bik、Noxa、Puma、Hrk等,僅含有促進細胞凋亡活性所必需的致死性結構域BH3基因序列[11-15]。

2 Bcl-2在細胞凋亡中的作用機制

細胞凋亡是一種復雜而精細的程序性細胞死亡過程,在胚胎發生、免疫、組織發育和內環境穩定維持等方面發揮著重要作用[16]。相關研究證實,細胞凋亡過度或凋亡過少等病理狀態均可誘發慢性難愈合創面、癌癥等的形成。Bcl-2作為與細胞凋亡最密切相關的基因,在多孔動物(海綿)、刺胞動物(海葵、珊瑚、水母)、扁殼動物及哺乳動物等多種多細胞動物中均有發現,可通過啟動Bcl-2家族及半胱氨酸蛋白酶(Caspase)家族相關凋亡因子的釋放,以及與特定因子相互結合后控制線粒體外膜(mitochondrial outer membrane,MOM)的完整性而調控細胞凋亡過程[17-18]。

2.1 Bax/Bak的促凋亡作用

Bax和Bak是Bcl-2家族中發揮促細胞凋亡作用的主要蛋白,是調控線粒體細胞凋亡過程的重要組成部分[19]。正常情況下,Bax主要位于細胞質中,Bak主要位于線粒體膜上,當細胞接收到凋亡刺激后,細胞質中的Bax遷移并作用于MOM形成孔狀通道,使激活Caspase家族的凋亡因子逃逸,進而誘導細胞凋亡。而Bak可直接在線粒體內與自身或Bax蛋白結合形成線粒體跨膜通道而誘導細胞凋亡。

2.2 Bcl-2蛋白的抗氧化作用

相關研究顯示,Bcl-2蛋白過度表達和磷酸化均可減少氧自由基的產生和脂質氧化物的形成,進而抑制細胞的凋亡,其作用機制可能與細胞生長、增殖、DNA修復有關。CHANVORACHOTE等[20]的實驗表明Bcl-2的抗氧化作用是間接的,即可能在于抑制超氧陰離子的產生而不是直接清除活性氧。細胞色素C作為呼吸鏈中重要的電子傳遞體,它從線粒體內膜上的釋放會阻斷電子向下游傳遞并危及呼吸鏈的功能,導致超氧陰離子的加速產生。而Bcl-2蛋白可以抑制細胞色素C的釋放,從而通過抑制超氧陰離子的產生,進一步抑制細胞凋亡。此外,線粒體的巰基可能組成了細胞內氧化還原電位的傳感器,Bcl-2可能通過抑制細胞內的谷胱甘肽(GSH)等抗氧化劑的外泄,促進谷胱甘肽進入細胞核內,降低細胞內的氧化還原電位,從而抑制細胞凋亡[21]。因此,Bcl-2蛋白的性質遠非僅僅是一種抗氧化劑。

2.3 Bcl-2、Bcl-X1和Bax的協同抗凋亡作用

Bcl-2家族蛋白在促進細胞生長和生存方面發揮著關鍵作用,凋亡的內在途徑主要是通過阻斷Bcl-2家族促凋亡蛋白,從而抑制細胞凋亡[22]。Bcl-2家族蛋白中Bcl-2、Bcl-X1和Bax相互作用,在線粒體上形成離子通道并降低線粒體膜通透性(mitochondrial membrane permeabiliti,MMP),進而影響巨孔的形成。同時,細胞色素C從線粒體內膜上釋放,激活Caspase-9,隨后細胞色素C和凋亡誘導因子(Apaf-1)結合并激活Caspase-3,而活化的Caspases-3降解底物后,其蛋白降解產物又引起線粒體通透性改變,抑制線粒體釋放促凋亡蛋白,并最終導致細胞凋亡發生[23-24]。

2.4 BH4結構域維持細胞內鈣離子穩定

Bcl-2蛋白的BH4結構域主要是作為控制細胞內Ca2+信號的關鍵決定因素出現的,可特異性靶向作用于1,4,5-三磷酸肌醇受體(inositol 1,4,5-trisphosphate receptors,IP3Rs)和ryanodine受體(ryanodine receptors,RyRs)等多個細胞內Ca2+轉運通道,促使Ca2+從內質網腔內釋放至細胞基質,并介導Ca2+通過線粒體外膜進入線粒體的電壓依賴性陰離子通道[25](voltage-dependent anion channels,VDACs)而維持線粒體內鈣離子穩定,阻止線粒體膜電位下降和線粒體通透性轉換孔開放,從而抑制細胞凋亡;亦或與膜糖蛋白復合物結合,形成內質網上的膜鈣通道,進而抑制鈣介導的凋亡起始階段[26-27]。

3 Bcl-2在創面修復中的作用

近年來,關于創面修復的細胞凋亡機制成為創面修復領域的研究熱點之一,細胞的增殖和凋亡參與調控創面愈合過程中的多個環節而影響其預后。細胞凋亡是一種重要的生物學現象,就創面修復而言,一般經歷炎癥期、肉芽組織形成期和上皮化的過程。組織損傷與修復的整個過程均有細胞凋亡機制參與,特別是上皮細胞與成纖維細胞在組織修復中增殖與凋亡之間的平衡決定和影響著創面修復的進程、結局和預后。細胞凋亡分為三個基本時相,即啟動(誘導)相、效應(調控)相、清除(降解)相。啟動相接受體內外死亡信號指令如加熱、輻射、毒素、腫瘤壞死因子等,經過凋亡信號轉導途徑(Bcl-2途徑)到達效應相。效應相時眾多促凋亡和抗凋亡基因相互制約處于動態平衡中,一旦進入清除相,Bcl-2激活Caspase-3,進而激活核酸內酶,激活的DNA酶游離出來使DNA降解,導致細胞凋亡[28-29]。

關于創面愈合過程中細胞凋亡時的形態學及生化變化受Bcl-2家族調控的研究較多。鄭敏等[30]的研究顯示,糖尿病足創面的發生及發展可能與Bcl-2水平降低及Bax水平升高造成的組織細胞凋亡率上升有關;李金鳳等[31]通過建立大鼠燒傷創面模型觀察油桐花水提物對燒傷創面Bcl-2、Bax表達水平的影響發現,油桐花水提物可通過提高抗凋亡因子Bcl-2水平、降低促凋亡因子Bax水平而抑制細胞凋亡的發生,進而促進燒傷創面愈合;曾娟妮等[32]的研究發現,美洲大蠊提取液可通過提高Bcl-2水平、降低Bax及Caspase-3水平而調控透明質酸和蛋白聚糖的表達,促進慢性難愈合創面的愈合。這些研究表明促進創面修復的機制可能是通過調節Bcl-2、Bax比例來調控細胞凋亡。

YAN等[33]的研究發現,片仔癀可降低糖尿病潰瘍小鼠創面組織中活性氧自由基水平,促使ROS/Bcl-2/Bax/Caspase-3通路失活而減少表皮成纖維細胞凋亡,進一步驗證了Bcl-2蛋白過度表達可降低氧自由基的產生,進而抑制細胞的凋亡,促進創面愈合。DING等[34]的研究顯示,經Bcl-2修飾的脂肪源性干細胞(adipose-derived stem cells,ADSCs)可上調Bcl-2及旁分泌因子水平,通過含孔支架遷移提高細胞存活率,延緩ADSCs凋亡,進而促進糖尿病小鼠創面愈合。總體而言,Bcl-2-ADSCs-scaffold可以有效加快愈合過程,促進創面植入后的新生血管形成,縮短創面愈合時間。

4 小結與展望

隨著Bcl-2家族蛋白研究的不斷深入,越來越多的學者研究發現Bcl-2家族蛋白可通過Bax/Bak發揮促凋亡作用、抗氧化作用、協同促凋亡作用、維持細胞鈣離子穩定等參與細胞凋亡的調節,在創面修復和再生的不同階段發揮作用。但迄今為止有關Bcl-2/Caspase信號通路促進創面愈合的應用研究多停留在動物實驗層面,在人體中的應用研究較少。

創面再生在再生醫學中的應用一直是一個迫切需要解決的問題,人們為此投入了大量的精力和時間。在各種基因中過表達Bcl-2可以促進細胞生存,誘導各種創面再生過程。同時,Bcl-2信號通路的激活可誘導多個信號通路發生相應的變化,進而參與創面愈合的整個過程,這是Bcl-2多效性效應的基礎。鑒于Bcl-2在創面修復和再生的不同階段發揮著不同的作用,對創面修復的研究可能會集中抑制Bcl-2信號轉導,未來的治療有望在創面修復給予Bcl-2抑制劑,加速創面愈合進程,減輕患者疼痛。進一步研究Bcl-2可能是更容易實現創面再生的重要途徑,研發促進Bcl-2生成劑的藥物應用于創面修復,未來也是一種無限可能。

綜上所述,Bcl-2在創面修復中體現的作用,不僅僅是通過升高Bcl-2的濃度,降低Bax水平,還可以通過各種外部因素刺激其活性,抑制下聯反應,促進創面修復。目前大量研究比較散在,沒有形成網絡整體性研究,要么是終點研究,未見時效關系,對于創面更是如此,因此探索以Bcl-2為基點的具有網絡整體及時效性的研究可能是未來研究方向。