基于固態13C NMR 的泥炭土腐植酸存在的證據

Patrick G. Hatcher Derek C. Waggoner Hongmei Chen 著

張 潞2 黃心如2 王笑晗2 陳賢淑2 趙紅艷2* 譯

1 美國歐道明大學化學與生物化學系 弗吉尼亞州 23529

2 東北師范大學地理科學學院 長春 130024

長期以來普遍認為腐殖質是土壤有機質（SOM）的主要成分，占土壤有機質的50%或以上，占全球大氣和海洋中總碳的兩倍以上。腐植酸，被定義為SOM 的堿溶、酸不溶成分，連同酸溶和堿溶的黃腐酸以及堿不溶的腐黑物，代表SOM 中被認為是來源于植物、在氧化環境中經歷了生物和非生物降解和/或二次合成的那部分物質。最近，一些人試圖駁回這一長期存在、經過幾十年研究認可的概念，并提出一個新觀點，完全挑戰腐殖質的存在，推測SOM 由小分子組成，主要是因為它們被包裹在土壤中的礦物質中（Schmidt 等，2011；Kleber 等，2015；Lehmann 和Kleber，2015）。這個新假設的核心，在很大程度上未經證實，這個被稱為土壤連續體模型（SCM）的新觀點，認為沒有證據表明植物降解后的二次合成形成腐殖化的有機質，所有植物生物聚合物成分（碳水化合物、蛋白質、木質素、單寧和脂質）以總體上相同的速度降解為小分子（Lehmann 和Kleber，2015）。從SOM 中提取的腐殖質，特別是腐植酸，被認為是堿性條件下產生的人工制品，它們在SOM 中并不存在。

Lehmann 和Kleber（2015）聲稱多維溶液核磁共振（NMR）研究（Kelleher 和Simpson，2006）證明腐植酸主要由植物來源的生物聚合物的小分子組合而成，沒有證據表明是通過二次合成形成的復雜分子。雖然我們同意腐殖質是小分子（＜1000 Da）的集合體，但我們不能接受二次合成在這一過程中不存在的觀點。我們的看法是，植物生物聚合物確實能降解，但不完全降解，在這個過程中，小分子形成聚集體，可以進行反應或化學改性，我們稱之為二次合成。他們還聲稱，進一步對不同粒級土壤的固態13C NMR研究表明，枯枝落葉層中的植物生物聚合物通過生物降解而均勻損失（Baldock 等，1992），因此在富含礦物質的組分中，唯一的殘留物是微生物殘體。

在本報告中，我們通過考查3種低礦質泥炭土，一種富含鐵（Fe），另一種含有適量的鐵，第三種不含鐵，與傳統的黃腐酸和腐植酸的堿提取物進行比較，提供的證據挑戰了腐殖質是合成產物的解釋，并表明這一觀點存在顯著缺陷。我們追蹤了2 種泥炭中每個組分的產量，并通過固態13C NMR 定量技術對整個土壤和相關組分進行了分析。

Cao 和Schmitt Rohr（2018）通過使用類似的13C NMR 方法比較來自許多地方的腐植酸與植物生物聚合物，挑戰了土壤中不存在腐殖化作用這個觀點。在他們的論文中，他們質疑溶液NMR 的證據，認為它不能代表腐植酸，因為Kelleher 和Simpson（2006）使用的尖峰信號可能失真。基于我們在固體和溶液NMR 方面都有豐富的經驗（Hatcher 等，1981；Simpson 等，2003），我們同意這一評論。腐植酸通常被認為是降解的植物生物聚合物通過氧化改性而形成，以至于它們具有相當大量的含氧官能團。與原有的生物聚合物相比，降解過程也降低了它們的分子大小。這些特性（功能和大?。Q定了它們在稀堿中的溶解度，使得它們容易被多種過渡金屬螯合，特別是鐵，導致在溶液中形成聚集體。這兩個過程的共同作用是顯著改變它們的NMR 自旋晶格和自旋-自旋馳豫，以至于它們相對于源自沒有這些特征的結構化植物生物聚合物的分子，在多維溶液NMR 中的可觀察性差（Cao 和Schmidt Rohr，2018）。

在固態13C NMR波譜學中，聚集效應不是問題，但順磁性金屬的影響眾所周知，特別是如果這些金屬在有機碳中心的25-? 半徑之內。一些研究強調了在土壤或類土壤材料中的這種效應（Pfeffer 等，1984；Dai 和Johnson，1999；Smernik 和Oades，1999；Smernik 和Oades，2002；Schwertmann 等，2005），并試圖從SOM 中去除鐵，但效果一般。這個過程中可獲得更高分辨率的NMR 波譜，但是，通過氫氟酸消解法去除鐵被證明降低了碳回收率（Gonsalves，2003）。我們的策略是考查3 種鐵含量不同的泥炭，并通過離子交換從腐植酸中去除鐵，從而使NMR 波譜不受影響。

本報告的結果很簡單。我們獲得了以下3 種固態13C NMR 定量波譜（i）原始泥炭、（ii）腐植酸和（iii）通過標準方法提取和分離的腐黑物，即用離子交換樹脂處理堿提取物以去除鈉和其他金屬。然后將提取物和不溶性腐殖質凍干，并按與原始土壤產量相同的比例加入，形成重組的泥炭SOM。我們的目標是挑戰Lehmann 和Kleber（2015）提出的關于堿提取會產生人工制品的觀點。如果腐殖質是人工制品，那么重組土壤的波譜就不會與原始的波譜相似。Cao 和Schmidt Rohr（2018）已經再次證實了眾所周知的植物生物聚合物與腐殖質提取物不相似，這一點在之前的許多研究中得到了證實（Atalla 和Vanderhart，1984；Tegelaar 等，1989；K?gel-Knabner 等，1992；Preston，1996）。這些發現本身就表明，二次合成是真實發生的。如果腐殖質提取物與原始泥炭或腐黑物有顯著差異，并且重組后的泥炭譜與原始泥炭譜完全吻合，那么這將表明堿性處理對SOM 沒有實質性的改性，與Lehmann 和Kleber（2015）的說法相反，腐殖化過程在泥炭中著實存在。然而，如果腐植酸的波譜與原始土壤有很大的不同，并且重組產生的波譜與原始土壤有顯著的不同，那么可能有幾種解釋：（i）腐殖質提取物是人造的前提假設有效，和（ii）腐植酸存在于整個土壤中的原始波譜受到順磁性金屬的影響，并不能定量代表被分析的有機質。

1 材料和方法

Okefenokee 沼澤（美國喬治亞州）的落羽松屬泥炭及其相應的腐植酸組分和腐黑物組分來自之前的一項研究（Hartman 等，2015）。Indonesia（印度尼西亞）的泥炭樣品之前也研究過（Orem 等，1996）。第3 個樣品來自Everglades（美國大沼澤地國家公園第二保護區）的中心部分。樣品通過改進的國際腐殖質學會（IHSS）方法進行制備。簡單地說，泥炭樣品在氮氣（N2）保護下用0.1 M 氫氧化鈉（NaOH）提取24 h，用離心法從可溶性腐植酸-黃腐酸組分中分離出腐黑物組分，再用超純水洗滌腐黑物、再離心，直至呈中性，再進行凍干。將含有腐植酸和黃腐酸的氫氧化鈉提取物用陽離子交換樹脂（Dowex 50WX8）處理去除鈉和其他金屬，然后使用鹽酸（HCl）酸化（pH=2），使深色的腐植酸沉淀，再采用離心法分離腐植酸和黃腐酸，之后凍干。最后的腐植酸殘渣用稀鹽酸沖洗幾次，然后凍干。對于Indonesia 泥炭樣品，在13C NMR 分析之前，將腐黑物、腐植酸和黃腐酸的凍干組分用研缽和研杵重新混勻。

在島津TOC-VCPH（島津科學儀器公司）上，通過高溫燃燒（720 ℃）測量溶解有機碳和總溶解氮濃度。用鄰苯二甲酸氫鉀（KHP）和硝酸鉀（KNO3）制作標準校準曲線，分別確定溶解有機碳和總溶解氮濃度。

采用含CHN 柱的元素分析儀（Flash 1112 系列）測定顆粒樣品中的有機碳含量和氮含量。取約1.5 mg 樣品放在3.3 mm×5 mm 錫杯中，在900 ℃下有氧燃燒，利用標準煙酰胺化合物提供校準曲線。

總鐵濃度采用配有鐵空心陰極燈的日立Z8100 偏振塞曼火焰原子吸收分光光度計測定。鐵標準是用硫酸鐵在稀硝酸（2% HNO3，痕量金屬級）中作為參考標準溶液而得到。玻璃瓶酸洗后用于樣品儲存和處理。分析過程如下：約5 ～10 mg 樣品在500 ℃爐中燃燒16 h 以上，然后，將得到的灰分用4 mL 濃酸混合物（1 ∶1 HNO3/HCl，V/V，痕量金屬級酸）在85 ℃下消解并慢慢排氣。待液體蒸發至初干后，再加入4 mL 濃酸混合物重復消解和蒸發過程。之后，將干燥后的殘渣懸浮在4 mL 的8 M HNO3中，并在5000 轉/分下離心15 min。此沖洗和離心過程重復一次，將上清液合并，在85 ℃下蒸發至初干。然后，在火焰原子吸收測量之前，將樣品重新溶解在4 mL 2%HNO3之中。

所有NMR 實驗均在配備有4-mm H-X 魔角旋轉（MAS）探頭的Bruker Advance II 波譜儀上進行，1H 共振頻率為400 MHz，13C 共振頻率為100 MHz。將13C 化學位移校準為甘氨酸外標（176.03 ppm）。使用復合脈沖多次交叉極化（multiCP）收集定量的13C NMR 波譜，與直接極化NMR 實驗相比較，具有更大的信噪比（Johnson和Schmidt Rohr，2014）。將60 ～100 mg 的樣品裝入鋯轉子中，用Kel-F 蓋子密封后進行分析。對每個樣品的采集參數進行了優化，在14 千赫茲的旋轉速率、0.4 秒的可變復極化周期（Tz）和1 秒的循環延遲進行5000 ～10000 次掃描。Cao 和Schmidt Rohr（2018）的研究表明，腐植酸和生物聚合物的多次交叉極化MAS（CPMAS）產生的波譜幾乎等同于定量的直接極化MAS。

2 結果和討論

3 種泥炭來源的凍干泥炭土的固態13C NMR 波譜如圖1 所示。來自Indonesia 的樣品被視為低鐵泥炭（Wüst 等，2008 年），因為它采自于一個大的貧營養沼澤，那里的水和無機物主要來自于降雨。Okefenokee 樣品也來自泥炭環境，但這片沼澤的面積更為有限，位于美國東海岸附近的一個近海盆地。第3 個樣品來自佛羅里達州的Everglades 大沼澤。表1 中列出了總鐵的測量結果，與Indonesia泥炭相比，Everglades 泥炭和Okefenokee 泥炭富含鐵。3 個泥炭全土的波譜（圖1）在存在的峰和相對豐度方面非常相似，主要變化是碳水化合物含量，即在65、72、84 和105 ppm 時的信號。代表脂肪族的主要峰在30 和33 ppm，具有典型的角質層特征，主要來自于葉凋落物。57、120、130 和150 ppm 的峰是木質素的特征。3 個樣品在175 ppm處的峰，主要與羧基或酰胺官能團有關。最后，在175 和220 ppm 之間觀察到醛/酮碳的信號。

從3 個泥炭樣品中提取的腐植酸的固態13C NMR 波譜如圖2 所示。最引人注目的觀察結果是腐植酸譜圖的相似性，以及芳香碳的強度明顯高于各自全樣，特別是130 ppm 處的大峰。同樣明顯的是，脂肪族碳的強度較低（0 ～50 ppm），特別是在Everglades 腐植酸中（圖2）。33 ppm 處的尖峰屬于在葉角質層中發現的有序聚亞甲基結構，是腐植酸波譜的一個次要成分。在57、120、130和150 ppm 的腐植酸波譜中，木質素的主峰也清晰可見。由175 ppm 處峰表示的羧基/酰胺官能團的增加強度與芳族碳成比例，這可能是他們被NaOH溶解的原因。歸一化為芳香碳后，腐植酸中羧基/酰胺峰的相對強度與所在全樣的相對強度相似，表明腐殖質和泥炭全樣之間存在類似的芳香結構單元。當腐植酸的波譜與各自的全土進行比較時，主要差異在于脂肪族結構和碳水化合物顯著減少，導致芳香族和羧基/酰胺官能團選擇性富集。這些觀察結果與以下觀點一致，即選擇性溶解是腐殖質和SOM 之間主要波譜差異的原因，而不是一些無法解釋的化學變化，即與NaOH 反應產生人工制品。

圖1 3 個泥炭樣品的固態13C 核磁共振（NMR）波譜Fig.1 Solid-state 13C nuclear magnetic resonance (NMR)spectra of the three peat samples.

圖2 3 個泥炭腐植酸樣品的固態13C 核磁共振（NMR）波譜Fig.2 Solid-state 13C nuclear magnetic resonance (NMR)spectra of the three peat humic acid samples

為了在不受Fe 影響的樣品上檢驗這一假設，我們基于傳統的堿提取法將Indonesia 泥炭樣品分離為幾個組分。如上所述處理泥炭全樣，以分離腐植酸、腐黑物（不溶于堿）和黃腐酸（堿和酸溶組分）。表2 顯示了每個組分的百分含量。用0.1 M NaOH 進行堿提取，從這個低灰分（0.75%）和低Fe 含量的泥炭樣品（表1）中去除了約一半的有機質。提取物主要是腐植酸，占樣品的42.2%，而黃腐酸則占9.8%。腐黑物的固態13C NMR 波譜見圖3。在黃腐酸組分中回收的材料不足以獲得NMR波譜。腐黑物的波譜表明存在顯著的碳水化合物衍生信號（65、72、84 和105 ppm），這證實了泥炭的這些成分沒有在堿液中溶解、而是作為堿提取的不溶性殘渣（腐黑物）中的主要成分。由于碳水化合物信號相當尖銳，并且在84 ppm 時存在明確的信號，因此該碳水化合物很可能是不溶于堿的結晶纖維素（Atalla 和Vanderhart，1984）。由0 ～50 ppm 范圍內的脂肪族尖銳信號表示的脂肪族、葉角質層衍生的物質在腐黑物中也比在腐植酸中更突出，線寬更窄，這表明它們也是原始植物殘渣，在堿中的溶解度有限。最能說明問題的是，指示木質素的峰（57、120、130 和150 ppm）顯示了一個更典型的未改變或最小改變的木質素分布模式，在57 ppm 和150 ppm 分別為甲氧基和氧取代芳基的強峰，正如所觀察到的那樣，是從新鮮木材或僅部分改變的木材中分離木質素最強峰（Hatcher，1987；Holtman 等，2007；Mastrolonardo 等，2015；Cao 和Schmidt Rohr，2018）。腐植酸中木質素峰（圖2）在57、120、130 和150 ppm 處顯示不同的相對強度分布，表明腐植酸中木質素衍生成分已從其在新鮮植物材料中的原始狀態改性，例如，甲氧基在57 ppm 處峰不像在分離木質素中那樣突出，在150 ppm 處的峰不如在130 ppm 處的峰?；蛘?，木質素的峰可能保留了它們的相對強度，但是在樣品中已經進化的新材料在130 ppm 產生大信號，該信號與木質素在該區域的信號重疊。

Lehmann 和Kleber（2015）認為這證明NaOH改性了泥炭樣品。與之形成鮮明對比，我們認為腐植酸代表被腐殖化的原始植物材料，這些植物材料經歷了二次轉化，以至于它們比未改變的植物生物聚合物更溶于稀堿，并且其波譜與腐黑物中改變最小的植物衍生聚合物不同。僅憑波譜無法確定上述哪種解釋更有效。

表2 凍干泥炭樣品中腐植酸、黃腐酸和腐黑物的重量百分比Tab.2 Weight percentage of humic acids, fulvic acids,and humin in the freeze-dried peat samples %

圖3 泥炭樣品中腐黑物的固態13C 核磁共振（NMR）波譜Fig.3 Solid-state 13C nuclear magnetic resonance (NMR)spectra of humin from peat samples

NaOH 人工制造腐植酸的的情況，一個實驗是將每個堿分離的干燥提取物（腐黑物、腐植酸和黃腐酸），按照在泥炭中相同的比例將它們重組，然后將重組的波譜與原始泥炭的波譜進行比較。圖4 顯示了Indonesia 和Everglades 泥炭的比較。原始泥炭波譜本質上與重組組分相同，僅在100 ～160 ppm 的共振區域（芳族區域）存在微小差異。這種重建原始樣品波譜的能力強烈表明堿提取不會產生人工制品，并且，腐植酸是泥炭中的真實成分，特別是考慮到腐殖質提取物占Indonesia 泥炭樣品很大的質量比（表2）。

100 ～160 ppm 區域共振強度的微小差異可能與通過離子交換樹脂處理去除腐植酸和黃腐酸組分中的某些有機物有關?；蛘?，這可能是由于腐植酸通過離子交換去除了一些鐵。我們正在仔細研究這種可能的影響，并將在適當時候報告這一點。

圖4 Indonesia 和Everglades 泥炭全土和重建泥炭土的疊加固態13C 核磁共振（NMR）波譜Fig.4 Superimposed solid-state 13C nuclear magnetic resonance (NMR) spectra of whole soil and the reconstituted Indonesia and Everglades peat soil

我們應用Baldock 等（2004）的生物聚合物混合模型到Indonesia 和Everglades 泥炭的全土、腐黑物、腐植酸以及重組樣品的波譜上（圖5）。混合模型假設SOM 由生物聚合物（碳水化合物、木質素、脂質、蛋白質、炭和不屬于任何生物聚合物類別的額外羧基官能團）的混合物組成，其NMR波譜信號預期是由每個單獨的生物聚合物構成，因為單個生物聚合物的存在形式不變。

數據表明，如上所述，模型中單個生物聚合物的相對貢獻對于2 種泥炭的全樣和重組組分是相似的。腐植酸和腐黑物組分在2 種泥炭樣品中的相對生物聚合物貢獻明顯不同。最大的區別與標記為炭的成分有關，而燃燒來源的生物炭是該成分的主要來源。通過波譜分析，發現2 種泥炭腐植酸分別含有約21%和31%的這種炭，而腐黑物下降嚴重，僅含8.3%和12.3%。此外，碳水化合物含量也差異顯著，其中，腐黑物分別富含26.2%和14.6%、而腐植酸分別僅含有5.2%和3.6%碳水化合物?？梢?，碳水化合物富含于腐黑物之中，因為它們在稀堿中的溶解度有限，在提取腐植酸過程中始終是不溶物。

圖5 Indonesia 和Everglades 泥炭腐植酸(HA)、全土、腐黑物和重組或混合樣品的固態13C 核磁共振(NMR)波譜的各種生物聚合物成分的相對含量Fig.5 Relative amounts of various biopolymer constituents from solid-state 13C nuclear magnetic resonance (NMR) spectra of humic acids (HA), whole soil, humin, and the recombined or mixed Indonesia and Everglades soil

最有趣的是，對于Indonesia 和Everglades 2 種泥炭樣品，炭在腐植酸中的濃度比在腐黑物中的高。通常生物炭非常不溶于水性溶劑（Bostick 等，2018），并被認為保留在腐黑物組分中，與此處觀察到的相反。

本研究中炭在用稀堿處理后變得可溶，并成為腐植酸組分，這一事實表明，該炭是從二次合成轉變而來。Chen 等（2014）表明，當溶解的有機質在模擬太陽光下降解時，會形成黑色沉淀，并且該物質可溶于稀堿。在該研究中，當pH=3.5 時觀察到沉淀，并且黑色沉淀物顯示為高度芳香性，由縮合的芳族碳組成，就像在燒焦的材料中通常觀察到的那樣。Chen 等（2014）提出，這種物質代表黑碳樣有機質，通過光化學產生的羥基自由基對溶解的有機質進行非燃燒氧化而形成。之后，DiDonato等（2016）、DiDonato 和Hatcher（2017）提出，這種存在于土壤腐植酸中的物質，在氧化過程中形成，產生了羥基自由基。Trusiak 等（2018）指出，羥基自由基容易在富鐵土壤中形成，這類土壤接收降雨帶進來的溶解氧。他們認為，隨后的有機質氧化會從土壤中釋放出二氧化碳。盡管Fenton化學是作用于SOM 的非生物過程，但文獻中有充分的證據表明土壤中的微生物（例如細菌和真菌）具有產生酶的能力，從而導致羥基自由基和其他的活性氧種類的產生（Crawford，1981；Higuchi，1990）。這些種類活性氧可以與土壤中許多SOM生物聚合物，例如木質素（Higuchi，1993）、多糖（Morelli 等，2003）和蛋白質發生反應（Sun 等，2017）。

在這樣的條件下，很可能發生Fenton 型反應將SOM 轉化為氧化產物，這些產物成為可提取的腐殖質，構成土壤的一部分，并且持續的Fenton氧化最終會在很長一段時間內導致礦化。因此，現代土壤中的腐殖質可以看作是SOM 礦化過程的中間產物。

我們的混合實驗表明，堿性提取物（例如腐植酸和黃腐酸）是現代SOM 的組成部分。

致謝和參考文獻（略）

譯自：Journal of Environmental Quality，2019，48：1571 ～1577。