腮腺皮脂腺癌的全外顯子組基因測序結果分析

鄭奔容 江博雄 王一娜 楊茂生 梁亞樂 王玉娥

皮脂腺癌（SC）是一種罕見的、具有侵襲性的皮膚惡性腫瘤，好發于老年人，常表現為紅色結節或者斑塊，有時可出現潰瘍，偶爾呈淡黃色。據報道，SC 的常見部位為眼瞼、面部、頭皮等處。按生長部位，SC 可分為眼周的SC 和眼外的SC，其中眼外SC 有不足2%發生于腮腺［1］。1953 年，Foote和Frazell 在一篇唾液腺腫瘤綜述中首次報道了一例皮脂腺腺瘤（SA）。6 年后，Rauch 和Masshoff報道了腮腺中的SC。截至2022 年12 月，外文文獻共報道了35 例腮腺SC 和10 例腮腺SA［2-3］。由于其罕見性，腮腺SC 的臨床病理特征和組織發生尚未完全闡明，而對于相關基因突變目前國內外報道較少。本文對一例腮腺SC 進行了腫瘤的全外顯子組測序，由于腮腺SA 更加罕見，本研究選擇了同為眼外皮脂腺良性腫瘤的頭皮SA 樣本作為對照，檢測全外顯子組基因突變在兩者中的差異變化，從而初步探討腮腺SC 發生的可能機制及治療的靶點。

材料與方法

一、標本來源

病例1 患者女，89 歲。因發現耳后腫物2 年于2022 年9 月至中山大學附屬第三醫院門診就診。彩色多普勒超聲（彩超）檢查提示右側腮腺內實性腫物，腫物大小約4.0 cm×4.0 cm×3.5 cm，考慮惡性腫瘤性病變。手術切除腫物后行病理學活組織檢查（活檢），診斷為腮腺SC。

病例2 患者女，51 歲。因發現頭皮腫物5 年于2020 年6 月至中山大學附屬第三醫院門診就診。通過詳細有全身檢查，排除頭皮外其他部位的腫瘤。體格檢查可見頭皮隆起型腫物，腫物大小約2.5 cm×2.0 cm×1.5 cm，邊界欠清，質硬。手術切除腫物后行活檢，診斷為SA。

本研究方案經中山大學附屬第三醫院倫理委員會批準（批件號：中大附三醫倫RG2023-117-01），患者均已簽署知情同意書。

二、方 法

1.取 樣

切取石蠟標本中的腫瘤及瘤旁組織或瘤旁組織，體積約0.3 cm×0.3 cm×0.3 cm。

2.DNA 的提取及建庫

提取石蠟包埋組織的DNA，用Qubit 對DNA濃度進行定量，以OD 值在1.8～2.0，DNA 含量＞1.0 μg 為建庫的標準。將符合標準的DNA 進行建庫，具體操作同文獻［4］ 。

3.數據處理及分析

篩選用于后續信息分析的高質量讀序（clean reads），使用BWA 軟件將clean reads 比對至人的參考基因組上，并通過Samtools 軟件處理，得到bam 文件，再用picard 軟件去除PCR 導致的重復reads，然后使用GATK 進行矯正；之后基于比對結果，使用基因組分析工具箱（GATK）軟件檢測單核苷酸位點變異（SNV）及長度小于50 bp 的插入和缺失（InDel），最后使用ANNOVAR 軟件對突變結果進行詳細注釋。

4.篩選高頻基因和驅動基因

去除位于Intron、UTR、IGR、RNA、Flank 的SNP 位點以及位于目標區域（突變function 為“.”或“unkown”）的InDel，利用MutSigCV 軟件篩選出高頻基因，同時參考文獻［4］比較體細胞變異與已知驅動基因，篩選出該腫瘤樣本中的已知驅動基因，具體操作同文獻［5］ 。

5.腫瘤異質性及亞克隆分析

利用SciClone 軟件將2 例腫瘤標本的變異等位基因頻率（VAF）及拷貝數變異（CNV）的拷貝數作為輸入文件，通過識別體細胞突變的數量及分析亞克隆的組成，追蹤亞克隆進化，得到每例腫瘤樣本的克隆性圖譜信息。

結 果

一、病理結果

病例1 腫瘤呈浸潤性生長，腫瘤細胞排列成大的巢團狀，部分巢團中央可見壞死，巢團周邊腫瘤細胞多呈基底細胞樣，核質比高，細胞異型性明顯，中央見散在體積較大、胞質呈多空泡狀的皮脂腺分化細胞，符合SC。見圖1。

病例2 腫瘤邊界清楚，由基底樣細胞和成熟的皮脂腺細胞構成，基底樣細胞大小形態較一致，細胞核呈卵圓形，可見小核仁，成熟皮脂腺細胞胞質豐富、呈多空泡狀，細胞異型性不明顯，未見確切核分裂及壞死，符合SA。見圖2。

圖1 一例腮腺SC 組織的HE 染色結果

圖2 一例頭皮SA 組織的HE 染色結果

二、全外顯子組測序及生物信息學分析結果

腮腺SC 及其癌旁組織、頭皮SA 及其瘤旁組織的測序數據與參考基因組比對的結果均達到要求，與參考基因組比對能達到 94%以上的比對率；平均100 倍測序深度時10 倍以上覆蓋度達到95%以上，見表1。腮腺SC 組織的SNV 數目為2012，頭皮SA 組織的SNV 數目為205，腮腺SC 組織的SNV 數目約為頭皮SA 組織的10 倍。腮腺SC 組織中的SNV 僅新發突變（未注釋上千人基因組或dbSNP 數據庫）數目為1 495（占75%），頭皮SA新發突變數目僅178（占86%），見表2。腮腺SC組織的SNV 類型（圖3）多于頭皮SA 組織（檢測結果見文獻［5］ ）。腮腺SC 組織、頭皮SA 的InDel數目分別為2017、50，新發突變數目為1 070、50。而CNV 的結果則分別為92 和90。

表1 全外顯子測序結果數據比對統計情況總覽

表2 驅動基因突變篩選結果

圖3 一例腮腺SC 的體細胞突變信息整合環狀圖

體細胞突變的數量及VAF 顯示腮腺SC 和頭皮SA 的亞克隆模式是有差異的，并且腫瘤倍性也不一致，腮腺SC 的多拷貝變異數量（圖4）多于頭皮SA 組織（檢測結果見文獻［5］）。在腮腺SC組織中還發現不同于頭皮SA 的57 個驅動基因突變，包括ABL1、β-肌動蛋白（ACTB）、異常紡錘體樣小頭畸形相關蛋白（ASPM）、鋅指同源框3（ZFHX3）和細胞核受體輔激活物基因（NCOA3）等基因。

討 論

雖然SC 的病因未明，但研究表明其可能與DNA 錯配修復（MMR）異常有關［5］。基因突變導致癌基因激活、抑癌基因失活，部分正常細胞的生長、分化出現異常，出現惡性失控從而形成惡性腫瘤。已報道的有關SC 基因突變多集中在眼部，針對眼部SC 的全外顯子組測序分析顯示腫瘤蛋白P53（TP53）、ZNF750、視網膜母細胞瘤基因1（RB1）是最常見的3 個基因突變，而PCDH15 是一種與轉移相關的新突變［6-9］。

圖4 一例腮腺SC 的亞克隆組成圖

目前有關眼外SC 的基因檢測分析數據極其罕見，尤其是腮腺SC 的結果尚未見報道。本研究通過對腮腺SC 和頭皮SA 進行全外顯子測序分析，發現腮腺SC 的基因突變總數和各突變類型均遠遠超過頭皮SA，說明腮腺SC 的基因突變非常活躍。此外，腮腺SC 中發現有別于頭皮SA 的57 個驅動基因突變，其中比較明確的癌癥相關基因 有ABL1、ACTB、ASPM、ZFHX3 和NCOA3 基因等。ABL1 基因是與白血病相關的原癌基因。當其易位到 22 號染色體長臂上時，會與斷裂點叢集區（BCR）基因發生融合從而形成 BCR-ABL 融合基因，該基因編碼的BCR-ABL 融合蛋白持續性活化，導致了白血病［10］。ABL1 激酶在實體瘤中的活化并不是因為發生染色體易位形成BCR-ABL 融合蛋白，而是由于 ABL1 激酶表達上調或ABL1 蛋白的上游激酶活化從而提高了 ABL1 的酪氨酸激酶活性。ACTB 被廣泛用于量化腫瘤表達水平。然而，ACTB 聚合與ACTB 細胞骨架形成的驅動細胞突起和細胞運動參與了癌癥的侵襲和轉移［11］。ASPM 基因位于人類1 號染色體，ASPM 在多種癌癥中異常表達，且與肝癌、卵巢癌、肺腺癌、胰腺癌和膀胱癌等多種惡性腫瘤的不良預后相關［12-14］。其缺失會影響細胞有絲分裂、分裂方向和分化方式，造成DNA 損傷增加和細胞凋亡。ZFHX3 作為非小細胞肺癌免疫檢查點阻斷的生物標志物，是已知的原癌基因，也是基底細胞癌相關基因［15-16］。NCOA3基因與癌癥相關，其體細胞基因拷貝數發生變化可導致轉錄水平發生變化，從而導致乳腺癌和胰腺癌的發生、發展。

頭頸部腫瘤的發展是一個綜合作用的結果，多種基因的突變相互作用，相互促進，形成了惡性循環。腫瘤異質性即腫瘤組織內部不同的腫瘤細胞或亞群中體細胞突變不完全相同。大部分的腫瘤存在亞克隆，而亞克隆突變與耐藥性相關。分析腫瘤的克隆結構有利于揭示腫瘤組織的異質性。分析腫瘤異質性和克隆結構有助于研究腫瘤的發展、進化、轉移、復發以及藥物反應等。本研究中，腮腺SC 的腫瘤異質性較頭皮SA 高，亞克隆多。本研究在腮腺SC 中發現了ABL1 基因的突變，而針對ABL1 突變發生的腫瘤，臨床有潛在作用的治療藥物包括伊馬替尼、達沙替尼、尼洛替尼、波蘇替尼、泊那替尼等。

綜上所述，腮腺SC 具有不同于良性腫瘤的基因突變及突變的模式。但本研究樣本量有限，進一步的研究需要更多的樣本進行相關基因突變的驗證。