鹽脅迫下夾竹桃生理光合特性及生態修復應用

丁偉倫陳慧英湯坤賢孫元敏蔡鷺春馬勇張飛

(1.自然資源部第三海洋研究所 廈門 361005;2.自然資源部海洋生態保護與修復重點實驗室 廈門 361005;3.自然資源部海峽西岸海島海岸帶生態系統野外觀測研究站 廈門 361005;4.福建省海洋生態保護與修復重點實驗室 廈門 361005)

0 引言

濱海植物是海岸生態系統的重要組成。一方面,土壤鹽堿化對植物造成根系鹽脅迫[1];另一方面,浪花飛濺、鹽霧等又造成植物地上部和葉片的鹽脅迫[2]。生長狀態抑制是植物對鹽脅迫的直觀表現[3],如株高、葉片數、莖長以及地上部分的干重等均有所下降等[4-5]。采用賦值法能有效量化評價植株生長狀態[2]。鹽分產生的滲透脅迫使土壤水勢降低,導致植物根系吸水能力下降,引發生理干旱[6]。持續存在的滲透脅迫導致植物體內離子失衡,表現為離子毒害和營養元素虧缺,進而造成氧化脅迫導致細胞膜透性改變、機體代謝紊亂和有毒物質積累,最終影響植物的生長發育和表觀形態[7-9]。對此,植物會產生一系列生理響應來應對鹽脅迫。如產生脯氨酸、甜菜堿等一些滲透調節物質,以及通過抗氧化物酶的表達來清除活性氧,減少膜損傷,維持細胞正常的功能[10-12]。作為植物重要的生理過程,光合作用對環境變化非常敏感[13-14]。研究表明,鹽脅迫會造成植物光合作用和呼吸作用的抑制,進而影響植株正常的生長發育[15-17];在影響因素上,主要分為氣孔因素和非氣孔因素[18]。

作為一種龍膽目(Gentianales)夾竹桃科(Apocynaceae)的常綠灌木或小喬木,夾竹桃(Nerium indicum)在我國熱帶亞熱帶地區被廣泛栽植,兼具園林綠化、環境修復、觀賞和經濟價值等特點[19]。目前,國內外對夾竹桃的耐鹽研究主要集中在根系鹽脅迫,尚未見夾竹桃對葉片鹽脅迫耐受特性的文獻報道[16-17,20]。本課題組在野外實地考察時發現,不同植物根系、葉片的耐鹽能力存在差異。故本研究以夾竹桃為研究對象,分別開展夾竹桃根系和葉片鹽脅迫實驗,通過測定植物生長狀態、凈光合速率(Pn)、蒸騰速率(Tr)、水分利用率(WUE)、氣孔導度(Gs)、葉片飽和水分虧缺(WSD)和細胞膜透性等指標,探究夾竹桃根系、葉片對不同鹽脅迫的生理響應和耐受能力。以期能更好地評估其耐鹽特性,為植物耐鹽特性研究和夾竹桃在海岸生態修復應用提供參考。

1 材料與方法

1.1 實驗材料與地點

實驗苗木采用長勢良好,高約1.2 m 的2年生夾竹桃苗,種于直徑30 cm、高35 cm 的塑料花盆,種植基質為按1∶1土沙比混合的土壤。實驗地點位于自然資源部第三海洋研究所漳州古雷基地可通風大棚內。棚內溫度略高于外部,光強約為外部自然光照環境的2/3,濕度與環境差異不大,實驗時間為較干燥的12月至翌年3月。

1.2 實驗方法

1.2.1 根系鹽脅迫實驗

設置對照組(0%)和0.3%、0.6%、1%、2%、3%濃度的根系鹽脅迫組,每組10株重復。實驗用水采用粗鹽和地下水配置,用鹽度計(WTW Multi 3320)測量,調節至相應鹽濃度。各處理組在根系鹽脅迫階段每7 d澆一次對應濃度的鹽水,每次澆水量1 L。脅迫處理13周后,按相同間隔和澆水量正常澆水4周。

1.2.2 葉片鹽脅迫實驗

鹽度梯度及實驗用水配制同1.2.1,每組5株重復。葉片鹽脅迫階段,每7 d用噴壺對各處理組植株葉片噴灑對應濃度的鹽水,每次噴灑量0.5 L。噴至葉片表面濕潤并均勻掛有水珠;脅迫處理13 周后,按照1.2.1方式正常澆水4周。

上述兩個實驗均在每次澆水前查看葉片受損程度,并剪取各處理植株相同葉位的葉片,冰袋冷凍保鮮放入采樣箱內并帶回實驗室進行生理指標的測定。實驗前、鹽脅迫周期及正常澆水周期全程記錄植株生長狀態。

1.2.3 葉片光合參數測定

在根系鹽脅迫末期及正常澆水后測定葉片光合指標,測定時選取晴天下同一時段,分別挑選兩個實驗各組植株相同葉位的葉片,每組選3個,設定光強500μmol/(m2·s-1),用Li-6400XT便攜式光合系統測定儀(Li-Cor 6400,Li-Cor Inc.,Lincoln,NE,USA)測定葉片凈光合速率(Pn)、蒸騰速率(Tr)、水分利用率(WUE)、氣孔導度(Gs),每片葉3個重復。

1.2.4 葉片生理指標測定

將新鮮葉片用去離子水沖洗干凈后擦干,避開主脈用打孔器打取相同面積的圓葉片放入刻度試管,加入20 ml去離子水,真空干燥箱中用真空泵抽氣20 min后,搖勻靜置1 h,在室溫下測定初始電導率S1;然后將各試管加塞煮沸30 min,冷卻至室溫后測定電導率S2,按如下公式算得細胞膜相對透性(RMP)[21]:

葉片水分飽和虧缺(WSD)用飽和稱重法測定[22]。新鮮葉片取回后立刻測得鮮重(W f),純水浸泡一天后取出,吸干表面水分稱其飽和鮮重(Wt),然后放入烘箱105℃殺青15 min,再調至80℃烘干至恒重,測得干重(W d)。按如下公式算得WSD:

1.3 數據收集與分析

采用SPSS25.0 對測指標進行單因素方差(ANOVA)分析和Pearson相關性分析。將數據匯總入Excel后,用Origin 8.0制作圖表。

2 結果與分析

2.1 鹽脅迫對夾竹桃生長狀態的影響

生長狀態采用賦值法[2]進行量化作圖。圖1(a)表明夾竹桃生長狀態在根系鹽脅迫下均不同程度降低,其中,1.0%以上濃度的處理組生長狀態下降尤為顯著,根系鹽脅迫35 d后組間差異達到極顯著(P＜0.01)。正常澆水后,1.0%濃度及以下處理組植株生長狀態逐漸恢復至接近對照水平,成活率均為100%;2.0%及以上濃度處理組生長狀態回升較緩或難以恢復,特別是3.0%處理組有約40%植株枯死,組間差異為極顯著水平(P＜0.01)。根據生長狀態賦值表,生長狀態值長期大于2能夠耐受,小于2為不能耐受。說明夾竹桃對1.0%濃度及以下的根系鹽脅迫耐受較好,對2.0%及以上根系鹽脅迫耐受較差(圖1)。

相比于根系鹽脅迫,葉片鹽脅迫下夾竹桃生長狀態下降幅度整體較小(圖1)。其中1.0%及其以上濃度處理組在29 d以后生長狀態與對照比差異達到極顯著(P＜0.01),0.6%處理組在50 d以后生長狀態與對照比差異極顯著(P＜0.01);各處理組正常澆水后生長狀態具有不同程度回升,但0.6%、2.0%和3.0%處理組與對照比仍差異極顯著(P＜0.01)。總體上,各處理生長狀態值無論在脅迫期間還是正常澆水后均大于2,表明了整體上夾竹桃對各處理葉片鹽脅迫的較為耐受。

2.2 鹽脅迫對夾竹桃凈光合速率的影響

根系鹽脅迫對夾竹桃的凈光合速率(Pn)整體影響較大,見圖2(a),各處理組葉片Pn在根系鹽脅迫期間和正常澆水后組間差異均極顯著(P＜0.01)。其中,根系鹽脅迫下除2.0%濃度處理組外,其余組夾竹桃葉片Pn均為負值。這可能是由于光合測定位于脅迫階段末期,植株生長狀態下降明顯,各處理組葉片出現不同程度變黃、萎蔫,呼吸作用強于光合作用所導致。低濃度根系鹽脅迫組Pn低于高濃度處理組,可能是因為低濃度組的葉片氣孔導度較大,而高濃度組因受根系鹽脅迫影響嚴重,氣孔導度相對較低的原因。各處理組夾竹桃葉片Pn在正常澆水后均顯著上升,且與根系鹽脅迫濃度梯度呈負相關趨勢,這可能是高濃度的根系鹽脅迫使植株葉片光合系統嚴重受損所導致。

圖2 正常澆水前后夾竹桃葉片凈光合速率Fig.2 Net photosynthesis of Nerium indicum before and after normal watering

從圖2(b)可以看出,葉片鹽脅迫對夾竹桃植株脅迫前后組間的凈光合速率(Pn)影響均極顯著(P＜0.01)。葉片鹽脅迫下,各處理夾竹桃葉片Pn均有不同程度下降,3.0%組葉片Pn與對照組相比差異極顯著(P＜0.01),0.3%組葉片Pn與對照組差異顯著(P＜0.05),其余組與對照組差異不顯著(P＞0.05)。停止脅迫正常澆水一段時間后,0.3%組葉片Pn與對照組相比差異顯著(P＜0.05),其余組均與對照組相比差異極顯著(P＜0.01)。

2.3 鹽脅迫對夾竹桃蒸騰速率的影響

如圖3(a)所示,根系鹽脅迫期間各處理組葉片蒸騰速率(Tr)與正常澆水后相比組間差異極顯著(P＜0.01)。根系鹽脅迫下,1.0%濃度以上處理組植株Tr與其余組比差異極顯著(P＜0.01)。實驗過程中對照組植株Tr前后變化不大,正常澆水一段時間后,處理組植株Tr與對照組比差異極顯著(P＜0.01),各組間植株Tr差異不顯著(P＞0.05)。表明根系鹽脅迫對夾竹桃植株的蒸騰速率(Tr)影響較大且較為持久,正常澆水后仍不能恢復至對照水平。

圖3 正常澆水前后夾竹桃葉片蒸騰速率Fig.3 Transpiration rate of Nerium indicum before and after normal watering

葉片鹽脅迫下,如圖3(b)所示,夾竹桃植株蒸騰速率(Tr)各處理組間差異不顯著(P＞0.05);正常澆水一段時間后的各處理組植株Tr與脅迫期間各組差異極顯著(P＜0.01),其中3.0%處理組植株Tr極顯著低于(P＜0.01)其余正常澆水后各組,可能是由正常澆水后各組氣孔導度相對葉片鹽脅迫期間顯著提升導致。葉片鹽脅迫對夾竹桃Tr影響不大,可能是葉片具有發達角質層等特殊結構,使其能較好地抵御葉片鹽脅迫,但正常澆水后高鹽處理組受影響仍顯著,可能是持續的鹽脅迫造成的損傷。

2.4 鹽脅迫對夾竹桃氣孔導度的影響

植株會根據環境變化來調節氣孔關閉程度,進而影響光合、呼吸與蒸騰作用,提升其對環境適應性。根系鹽脅迫下,如圖4(a)所示,1.0%及其以下濃度處理組夾竹桃葉片Gs與對照組比差異不顯著(P＞0.05),2.0%及以上濃度處理組Gs與其余組比差異極顯著(P＜0.01),正常澆水后Gs組間差異顯著(P＜0.05)。這表明夾竹桃植株在高濃度根系鹽脅迫下,會通過氣孔導度降低的方式來影響光合、呼吸和蒸騰速率,以提升其應對外界環境脅迫的能力。

圖4 正常澆水前后夾竹桃葉片氣孔導度Fig.4 Stomatal conductance of Nerium indicum before and after watering

葉片鹽脅迫下,如圖4(b)所示,夾竹桃葉片氣孔導度(Gs)組間整體差異不顯著(P＞0.05),其中,3.0%處理組Gs較低,與1.0%和2.0%處理組比差異顯著(P＜0.05)。正常澆水后,各處理組葉片Gs均有不同程度提高,整體組間差異極顯著(P＜0.01),其中,3.0%處理組Gs分別與對照組、0.3%和0.6%處理組差異極顯著(P＜0.01),與2.0%處理組差異顯著(P＜0.05),其余組間Gs差異不顯著(P＞0.05)。即除3.0%處理組外,其余組正常澆水后植株葉片Gs能夠恢復至和對照組同一水平。

2.5 鹽脅迫對夾竹桃水分利用率的影響

如圖5所示,夾竹桃植株在葉片鹽脅迫下各處理水分利用率(WUE)組間差異極顯著(P＜0.01)。其中,1.0%及以上的處理組植株的WUE均與0.3%處理組比差異極顯著(P＜0.01),2.0%處理組植株WUE與0.6%處理組差異顯著(P＜0.05),3.0%處理組與0.6%處理組差異極顯著(P＜0.01),其余組之間差異不顯著(P＞0.05)。各處理組在停止脅迫正常澆水后組間整體差異不顯著(P＞0.05),其中3.0%與0.3%、0.6%、1.0%處理組WUE 差異顯著(P＜0.05),其余均組間差異不顯著(P＞0.05)。

圖5 夾竹桃葉片在正常澆水前后的水分利用率Fig.5 The water use efficiency of Nerium indicum before and after normal watering

2.6 鹽脅迫對夾竹桃細胞膜透性的影響

根系鹽脅迫濃度在1.0%及以下時,夾竹桃植株葉片細胞膜透性(RMP)無明顯變化,1.0%以上濃度處理組在脅迫后期細胞膜透性顯著升高,正常澆水后分別持續增大到39.22%和100%,可能是土壤中仍殘留一定濃度鹽分并繼續對夾竹桃植株造成脅迫導致,表明3.0%濃度根系鹽脅迫下夾竹桃植株細胞膜系統嚴重損傷而無法恢復,如圖6(a)所示。葉片鹽脅迫下,各處理組夾竹桃葉片細胞膜透性無顯著差異,如圖6(b)所示,最高峰出現在脅迫中期的2.0%和3.0%處理組,分別是28.40%和29.16%;正常澆水后夾竹桃葉片細胞膜透性最值出現在3.0%處理組,為24.88%。

圖6 不同濃度鹽脅迫下夾竹桃葉片細胞膜透性變化Fig.6 Changes of cell membrane permeability of Nerium indicum under different concentrations of root salt stress

2.7 鹽脅迫對夾竹桃葉片飽和水分虧缺的影響

當根系鹽脅迫濃度≤1.0%時,夾竹桃葉片水分飽和虧缺(WSD)與對照比變化不顯著,但根系鹽脅迫濃度＞1.0%時,葉片WSD 受脅迫影響均非常顯著,2.0%處理組植株葉片WSD 在正常澆水后有所恢復,但3%處理組WSD 在正常澆水后仍呈直線上升趨勢,如圖7(a)所示。夾竹桃植株在葉片鹽脅迫下各處理組WSD 整體差異不大,植株葉片WSD在停止脅迫澆水充足后有下降趨勢,如圖7(b)所示。

圖7 不同濃度鹽脅迫下夾竹桃葉片水分飽和虧缺變化Fig.7 Changes of water saturation deficit of Nerium indicum under different concentrations of salt stress

2.8 指標間相關性分析

將夾竹桃生長狀態、光合指標和生理指標通過Pearson相關性分析,如表1所示,夾竹桃植株的生長狀態與不同鹽脅迫均呈極顯著負相關關系。

表1 夾竹桃指標間相關性分析Table 1 Correlation coefficient among indexes

光合響應上,根系鹽脅迫下,夾竹桃葉片Pn與 鹽脅迫濃度極顯著正相關,Tr和Gs與鹽脅迫濃度均極顯著負相關,Pn和Tr均與Gs極顯著相關,表明氣孔因素作用極顯著。葉片鹽脅迫下,Pn與鹽脅迫濃度呈極顯著負相關,Tr和Gs與鹽脅迫濃度相關性不顯著,但Tr與Gs之間有極顯著相關性,植株WUE與鹽脅迫程度呈極顯著負相關性,其余指標間相關性不顯著。

生理響應上,根系鹽脅迫下,夾竹桃葉片WSD與細胞膜透性同鹽脅迫程度均為顯著正相關;WSD與細胞膜透性之間也極顯著正相關;葉片鹽脅迫下,夾竹桃葉片飽和水分虧缺與細胞膜透性同鹽脅迫程度相關性不大。

3 討論

3.1 夾竹桃對不同鹽脅迫的耐受性

耐鹽性指植物對鹽脅迫能全部或部分忍受,表現為不受傷害或受傷害較輕[16]。鹽脅迫對植物直觀影響的表現為生長抑制,如植株生長量減少、株高增長率降低等;且鹽脅迫濃度越高,生長抑制越明顯[23-25]。本研究表明,根系鹽脅迫和葉片鹽脅迫均會對夾竹桃植株生長和表觀形態產生影響;兩種鹽脅迫在表觀上均是從葉尖開始損害植株葉片,表征為不同程度的葉尖焦枯、卷曲、變黃與凋落。這與卞阿娜等[26]對甜土植物枇杷的根系、葉片分別受NaCl脅迫的研究結果一致。根據生長狀態賦值,根系鹽脅迫濃度≤1.0%時,夾竹桃生長狀態普遍大于2,且正常澆水后生長狀態能較好恢復;根系鹽脅迫濃度≥1.0%時,夾竹桃狀態向著小于2的方向發生不可逆下降。葉片鹽脅迫下夾竹桃生長狀態普遍大于2。因此,從生長狀態看,夾竹桃對濃度1.0%及以下根系鹽脅迫耐受性較好,對3.0%及以下葉片鹽脅迫耐受性均較好。

3.2 不同鹽脅迫下夾竹桃的光合響應

鹽脅迫會改變植物細胞的滲透壓,使過多的鹽分離子進入植物蒸騰流中,造成光合作用抑制、離子平衡破壞和膜脂過氧化等,從而損害植物細胞,影響植物生長和凈光合速率(Pn)[27-28]。本研究發現,根系鹽脅迫下,各處理組夾竹桃Pn 均大幅降低,與對照比差異極顯著;葉片鹽脅迫下,Pn下降幅度小于根系鹽脅迫,僅3.0%濃度處理組與對照組比下降極顯著。說明鹽脅迫會影響植株葉片Pn;根系鹽脅迫比葉片鹽脅迫對夾竹桃葉片Pn 影響更大。

Tr與Gs也是反映植株葉片光合效率的重要指標。氣孔通過調控植株水分運輸和對CO2的吸收來影響植物的蒸騰和光合作用[5]。本研究表明,根系鹽脅迫下,夾竹桃2.0%、3.0%處理組Gs與對照組比極顯著降低,Tr與Gs變化趨勢相同;葉片鹽脅迫下,夾竹桃各處理組Tr和Gs與對照組比均無顯著變化。Pearson 相關性分析表明,夾竹桃Gs與Tr、植株生長狀態呈極顯著相關,這與許大全[29]的觀點一致。特別是高濃度根系鹽脅迫下,氣孔因素對夾竹桃光合的影響較為顯著。說明不同根系和葉片鹽脅迫方式對植株光合作用影響不同,根系鹽脅迫對氣孔和蒸騰的影響比葉片鹽脅迫更為顯著;同種脅迫方式下,鹽濃度越高,Pn、Gs、Tr抑制越明顯[30-32]。Gs下降嚴重阻礙CO2向葉綠體擴散,導致細胞間CO2濃度和Pn的下降[24];同時減少蒸騰失水,緩解水分虧缺,降低鹽脅迫對植物生存的危害[33-34]。這與戴偉等[35]對包括夾竹桃在內的5種園林灌木在根系鹽脅迫下光合響應比較研究結果一致。

停止鹽脅迫正常澆水后,不同鹽脅迫處理組有不同程度恢復。其中,根系鹽脅迫處理組的各項光合指標在不同程度恢復的同時,與對照組比差異仍顯著,甚至有個別組為極顯著;葉片鹽脅迫處理組除Pn與對照組差異顯著外,其余指標與對照組差異不顯著。說明根系鹽脅迫比葉片鹽脅迫對夾竹桃光合作用抑制后恢復難度更大,影響更持久。

3.3 夾竹桃對不同鹽脅迫的生理響應

鹽脅迫會對植物細胞膜產生直接影響,使膜結構和功能受到損傷。植物在鹽逆境中細胞膜透性增加是組織受損的表現[36],這會對植株的水分利用[37]和光合作用產生影響[38]。本研究表明,根系鹽脅迫下,1.0%及以下濃度處理組夾竹桃葉片的細胞膜透性和WSD 與對照組比無明顯變化,2.0%和3.0%處理組在脅迫初期變化不大,但在脅迫后期,夾竹桃細胞膜透性和WSD 顯著升高;葉片鹽脅迫下,各組夾竹桃細胞膜透性和WSD 與對照組比差異不顯著。Pearson相關性分析表明細胞膜透性和WSD二者有顯著正相關性。停止脅迫正常澆水后,夾竹桃2.0%和3.0%根系鹽脅迫處理組WSD 與細胞膜透性的值和對照組相比仍然較高;2.0%和3.0%葉片鹽脅迫的處理組WSD 與細胞膜透性均有不同程度下降。總體上,根系鹽脅迫對膜的損傷和植株體內水分狀況的影響要大于葉片鹽脅迫。

可見,根系鹽脅迫前期,夾竹桃表現出一定程度耐受性,隨著脅迫時間延長,質膜透性顯著增強。說明高濃度根系鹽脅迫下,夾竹桃細胞膜受損程度比較嚴重,無法恢復至正常水平,這與耿曉東等[39]對小黃花菜的研究結果一致。同時,不同鹽脅迫下夾竹桃細胞膜透性、WSD 和生長狀態、光合作用變化趨勢可以很好對應,說明膜系統受損會反過來影響夾竹桃生長和光合作用,特別是光合膜系統的受損,會導致CO2同化能力降低[40],光合色素受損[41],以及其他非氣孔因素的光合抑制。

3.4 夾竹桃耐鹽特性的應用

通過對夾竹桃根系、葉片鹽脅迫的分別研究,能更好地評價夾竹桃的耐鹽特性。根據生長狀態賦值,綜合根系、葉片鹽脅迫下夾竹桃光合與生理響應的差異,筆者認為夾竹桃對1.0%及以下根系鹽脅迫濃度耐受較好,對3.0%及以下葉片鹽脅迫普遍耐受;總體上,夾竹桃葉片耐鹽能力強于根系耐鹽能力。大棚試驗模擬鹽霧對濱州楊梅幼苗造成的葉片鹽脅迫發現,其對植株影響甚微,可能原因是葉表面有厚厚的角質層限制了鹽分進入[42]。研究表明,我國境內夾竹桃葉片角質層發達,平均厚度為19.5±4.57μm,具有良好的保護作用[43]。因此,葉片鹽脅迫比根系鹽脅迫對夾竹桃影響較弱,可能與夾竹桃葉片本身具有發達的角質層,可以很好地抵御鹽分從葉片進入有關。

在濱海生態環境中,鹽分是植物生長的主要環境脅迫因子[44]。植株受鹽脅迫影響的部位和程度因分布高程和離海距離而異,其耐鹽性也就不同。生長在高潮位上灘涂或濕地的植株,受海水直接淹沒或浪花飛濺影響,根、莖、葉兼具很強耐鹽性;生長在地下水受海水入侵的沙灘后濱或離岸有一定距離低洼地的樹種,根系有較強耐鹽性;生長在一定高程海岸帶坡地的植物,葉片有較強的耐鹽性[1]。因此,在濱海植被修復和群落構建時,要因地制宜地綜合考慮植物根系、葉片耐鹽性的差異來選取樹種搭配。通過對夾竹桃根系和葉片鹽脅迫生理光合特性研究表明,夾竹桃能夠耐受較高濃度葉片鹽脅迫和低濃度根系鹽脅迫,比較適宜種植在有一定高程的海岸地帶,如濱海步道、海堤護岸坡頂等。該處植株根系受海水影響甚微,但莖和葉主要受鹽霧和海洋飛沫等影響較大。研究表明夾竹桃較強耐旱能力又能很好地適應該地帶水分供給不及時的情況[45]。此外,夾竹桃根系錯綜復雜,較多的細根能與土體形成有效加筋網絡,改善土體強度和變形特征同時提高海堤護岸邊坡淺層土體的穩定性[46]。綜上,本研究為夾竹桃在濱海生態化應用提供了理論指導。