SPRY2 基因在細胞表型中的研究進展

梅其杰 胡 琪 徐文飛 郭錦榮 李崇銘 張久一 袁長深 段 戡▲

1.廣西中醫藥大學第一附屬醫院關節四肢創傷骨科，廣西南寧 530023；2.廣西中醫藥大學研究生學院，廣西南寧 530000

眾所周知，目前許多疾病的病因病機尚未得以攻克。而隨著分子生物學技術的進步，這些疾病的機制逐漸得以證實。細胞表型及其功能的研究可以幫助了解相關基因、蛋白、藥物的機制，進一步解析疾病的病因病機，其漸漸成為基礎研究不可或缺的手段。科研工作者運用生物分子檢測手段判斷細胞表型及功能，推斷目的基因在組織細胞中的功能，進而闡述目的基因在相關疾病發生發展中的作用機制。

長鏈非編碼RNA（long non-coding RNA，lncRNA）、微RNA（microRNA，miRNA）、信使RNA（messengerRNA，mRNA）組成的表達網絡lncRNA/miRNA/mRNA 作為當前研究的熱點，其中mRNA 作為通路的下游因子，在細胞表型及功能的調控中起著關鍵作用。快速發育生長因子同源蛋白（sprouty，SPRY）作為一種關鍵的mRNA，是體內受體酪氨酸激酶（receptor protein tyrosine kinase，RTKs）信號傳導的抑制劑[1]，參與調控多種疾病發展；其在細胞中表達量的差異性會誘導出不同的細胞表型。由SPRY 轉錄翻譯的SPRY 蛋白是許多生長因子的共同拮抗劑，在調節生物體的生長和發育方面起著極為重要的作用。目前有4 種亞型：SPRY1、SPRY2、SPRY3 和SPRY4，其中備受關注的是SPRY2。與其他亞型比較，SPRY2 對RTKs 體酪氨酸激酶信號通路的抑制作用顯著增加，其獨特的生物效應在細胞表型的誘導中起著重要作用。冀為讓臨床工作者更充分地分認識SPRY2 在不同細胞表型中的功能，本文通過整理文獻并進行歸納；同時為SPRY2 的研究提供有力的理論支持。

1 SPRY 基因與蛋白

1.1 SPRY2 基因

SPRY 家族最早在果蠅基因的研究中發現，后來在哺乳動物中發現4 個家庭成員SPRY1、SPRY2、SPRY3和SPRY4。SPRY 作為RTKs 調控成纖維細胞生長因子（fibroblast growth factor，FGF）和表皮生長因子（epidermal growth factor，EGF）信號通路的拮抗因子。隨后，在人類胚胎干細胞中進一步證實SPRY2 是RTKs信號傳導和細胞過程的調控關鍵因子；其功能包括調控細胞活力[2]、新陳代謝、遷移[3]和細胞周期[4]控制等。在人類組織樣本中，SPRY2 廣泛表達于人體組織，如腎上腺、闌尾、骨髓等。SPRY2 的表達受復雜、多層次的不同信號通路調控，其復雜的生物學功能由其翻譯合成的蛋白來實現。

1.2 SPRY2 蛋白的結構特點

SPRY2 是一種含硅和含鐵的蛋白質，運用透射電子顯微鏡三維重構其結構，呈現出類似“甜甜圈”的形狀，帶有兩個松散連接的唇蓋部分，7 個大小不等的裂片和2 個部分覆蓋其孔兩側的唇裂，總共是9 個裂片。SPRY2 蛋白含有315 個人類氨基酸殘基（35 kD），178-282 C’末端殘基富含半胱氨酸。SPRY2 抑制多種RTKS 信號蛋白和調節細胞增殖過程主要由其獨特的、高度保守的、富含半胱氨酸的C’端結構域參與，該區域是SPRY2 膜易位所必需的。而SPRY2 蛋白的N’末端部分不太保守，這些序列差異可能是SPRY 蛋白之間功能差異的原因[5]。

2 SPRY2 的功能

SPRY2 通過拮抗RTKs 信號傳導及與各種生長因子相互作用賦予細胞特定的形態和功能，導致不同的細胞表型，包括增殖、凋亡、遷移、侵襲、自噬、上皮間充質轉化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）和血管生成等。

2.1 細胞增殖

SPRY2 作為調節細胞增殖重要的mRNA[6]，可通過調控細胞增殖影響癌癥的進展[7]。Liao 等[8]研究發現，下調SPRY2 表達可以增強RTK 活性并激活RTK/Ras/MAPK 信號通路，從而促進成骨細胞增殖。動物實驗研究發現[9]，過表達SPRY2 可抑制小鼠成骨細胞增殖表達；相反，用小干擾RNA 沉默SPRY2 后，與轉染對照組細胞比較，FGF 誘導的細胞外調節蛋白激酶1和2 活化增加。體外細胞實驗中[10]，集落形成測定法發現過表達ALKBH5 可抑制結直腸癌細胞增殖，敲低miR-21 可阻斷ALKBH5 pcDNA3.1 和FOXO3shRNA 的聯合作用，而SPRY2 shRNA 則可以逆轉這種作用；而在卵巢癌細胞的研究中發現[11]，敲低SPRY2可挽救GAS5 對A2780 細胞增殖的抑制作用；表明SPRY2 可影響細胞生長，為調控癌細胞增殖的關鍵mRNA。

SPRY2 本身不僅可有效調控細胞增殖，而且其增殖能力還具有特異性[12]。在Sprouty 家族中，SPRY2 和SPRY4 對細胞增殖的影響存在差異[13]：在骨肉瘤SPRY2 和SPRY4 蛋白水平低內源性細胞系U2OS 細胞中，SPRY4 異位表達10 d 后測量的細胞克隆數量并沒有減少，而SPRY2 表達使U2OS 細胞的克隆量減半；與SPRY4 比較，過表達的SPRY2 對U2OS 細胞在96 h 內并沒有翻兩番，而對照細胞幾乎翻了兩番。同樣，在野生型小鼠中[14]，SPRY2 在產前第18 天在脛骨的所有細胞類型中大量表達；表明SPRY2 對細胞增殖具有明顯的特異性。

2.2 細胞凋亡

細胞凋亡表現多基因（Bcl-2 家族、caspase 家族[15]等）嚴格控制的過程，該過程的紊亂可能與許多疾病的發生有直接或間接的關系，但具體過程及確切機制尚不完全清楚。敲除SPRY2 可調控ERK 信號，增加促MAPK 的活性，而MAPK 可促進凋亡Bcl-2 家族成員Bad 和Bim 的去磷酸化，從而誘導細胞凋亡導致黑色素瘤細胞死亡[16]。在胰腺癌細胞中，沉默SPRY2 可促進胰腺癌細胞從G0/G1期向S 期的轉變，減少凋亡細胞的數量；過表達SPRY2 對MIA PaCa-2 細胞的細胞周期進展和凋亡具有相反的影響[17]。為確定SPRY2對細胞凋亡的作用，蛋白質印跡法分析顯示，敲低SPRY2 導致Bax 和裂解半胱天冬酶3 的蛋白表達降低，而Bcl-2 蛋白表達增加，抑制細胞凋亡[18]。上述研究表明，SPRY2 在高水平表達時具有抗凋亡功能。

2.3 細胞遷移

細胞遷移逐漸成為當前細胞生物學研究的熱點，可作為認識相關疾病機制的另一條新線索。為明確SPRY2 對細胞遷移的調控作用，在肝癌干細胞中，miR-22-3p 降低了SPRY2 的泛素化并使其穩定，可抑制肝癌干細胞遷移和侵襲[19]；在成纖維樣滑膜細胞中，過表達SPRY2 可有效抑制成纖維樣滑膜細胞的遷移和侵襲，降低了炎癥因子[20]。為進一步了解SPRY2 對細胞遷移的特異性，分別用SPRY2 和SPRY4兩種腺病毒感染高內源性SPRY 蛋白水平的骨肉瘤MG63 細胞系，并在感染后48 h 進行劃痕測定，發現當僅SPRY2 過表達時，間隙縮小的時間顯著延遲，過表達SPRY2 可調控細胞遷移（1 h 內）覆蓋12 μm 的距離，而對照處理的細胞移動速度快約1.3 倍；而過表達SPRY4 不僅增加間隙閉合的速度，還起到非抑制作用[21]。另外在胰腺導管腺癌中發現[22]，SPRY2 可有效調控胰腺導管腺癌PANC-1 和SW1990 兩種細胞系的遷移速度；同時經跨孔遷移和侵襲試驗表明，敲除SPRY2 后細胞侵襲數量明顯增加，而過表達SPRY2 可顯著抑制兩種細胞系的遷移和侵襲能力；這表明SPRY2 為調節胰腺導管腺癌細胞中的遷移能力關鍵mRNA。

2.4 細胞侵襲

細胞侵襲是正常細胞和癌細胞應對化學和機械刺激的反應，又稱為細胞吞噬。SPRY2 作為MAPK 信號傳導的調節劑，在調節癌細胞侵襲中起著關鍵作用[23]。一項在體研究中發現，SPRY2 作為肝內膽管癌侵襲的腫瘤抑制因子，FGF1 刺激可顯著增加FGF 受體2 表達正常的腫瘤侵襲，但當FGF 受體2 被敲低時，HuCCT-1 細胞的侵襲減少，當SPRY2 被敲低時增加[24]。為了證實細胞遷移和侵襲的影響是否由SPRY2 介導，利用HepG2 模擬細胞，HepG2 過表達miR-22-3p細胞和HepG2 過表達miR-22-3p/SPRY2 敲低細胞的Transwell 遷移測定和基質凝膠侵襲測，表明SPRY2 可有效調節細胞侵襲[25]。進一步研究發現，將SPRY2 的載體引入A549-CUG2 細胞，發現過表達SPRY2 可抑制CUG2 誘導的細胞遷移和侵襲[26]；而沉默SPRY2 可升高MCF7 細胞中金屬蛋白酶水平，使細胞的侵襲能力明顯增強[27]。

2.5 細胞自噬

自噬作為細胞的一種自我保護機制，在真核細胞中廣泛存在，作為調節細胞生存和死亡的關鍵因素。細胞自噬基因突變會導致疾病，尤其是在腫瘤、炎癥及神經系統等疾病[28]。有研究將miR-122 Agomir 轉染到氧葡萄剝奪誘導的小鼠腦神經瘤細胞系N2a 中，發現過表達miR-122 可下調SPRY2 活力，降低N2a 細胞的細胞凋亡、細胞周期停滯和自噬；同時，觀察到S期細胞數量升高，用miR-122 Agomir 進行蛋白質印跡分析以評估細胞凋亡（Bax 和活性半胱天冬酶-3）和自噬相關蛋白（Beclin-2 和LC3B-Ⅱ），結果發現，用miR-122 Agomir 轉染后氧葡萄剝奪處理的N2a 細胞中Bax、活性半胱天冬酶-3、Beclin-2 和LC3B-Ⅱ的表達下降，提示低表達SPRY2 能夠抑制細胞自噬，加重缺血性卒中的神經損傷[29]；同樣，敲低SPRY2 可消除miR-22-3p 對細胞遷移和侵襲的抑制作用[19]。因此，SPRY2 有望成為研究細胞自噬的熱點。

2.6 EMT

EMT 是指上皮細胞通過特定程序轉化為具有間質表型細胞的生物學過程，而通過EMT，可獲得較高的遷移與侵襲、抗凋亡和降解細胞外基質的能力等間質表型。某些炎癥細胞來源的細胞因子，特別是轉化生長因子β（transforming growth factorβ，TGFβ）的表達升高，參與EMT，導致多種纖維化疾病的發病機制，而SPRY2 對TGFβ 信號具有負調控作用。為了進一步剖析SPRY2 如何調節TGFβ2誘導的EMT 和遷移的機制，在晶狀體上皮細胞中檢測ERK1/2 的磷酸化水平，發現它們分別參與規范和非規范TGFβ 信號通路的激活，表明SPRY2 通過抑制ERK1/2 磷酸化[30]來抑制TGFβ 信號傳導；另外，SPRY2 還可通過甲基化[31]增加了結直腸癌的癌癥表型和EMT。Liu 等[32]研究發現過表達SPRY2 可抑制miR-23b 表達，從而促進晶狀體上皮細胞的遷移和EMT。因此，SPRY2 對EMT 起關鍵調節作用。

2.7 血管生成

血管生成作為疾病的發展轉移過程的重要因素，其機制復雜，且參與并促進血管生成的因子也眾多。SPRYT 蛋白的N’端區域是高度發散的，除了果蠅和哺乳動物蛋白之間相似的兩個小區域。其中一個區域已被證明與泛素連接酶c-Cbl 結合，泛素連接酶c-Cbl 是RTK 信號傳導的已知負調節劑。c-Cbl 介導表皮生長因子受體、血小板衍生生長因子受體和集落刺激因子1 受體等多重泛素化，從而靶向通過蛋白酶體/溶酶體途徑降解[33-34]。SPRY2 作為膜錨定蛋白，可負調節血管生成相關RTKs 信號傳導并抑制血管生成，過表達SPRY2 可抑制FGF2 和血管內皮生長因子誘導的內皮細胞增殖和分化[35]。在外泌體miR-21靶向SPRY2 的研究中，證實miR-21/SPRY2 軸在正常血管上皮細胞生成和上皮表型調節中起關鍵作用[36]。

3 展望

SPRY2 作為一個雙抑制因子，廣泛表達在多種組織中，屬于Sprouty 家族的蛋白質。該蛋白間接參與非細胞自主抑制作用對成纖維細胞生長因子的信號傳導；與Cas-Br-M（小鼠）外向逆轉錄病毒轉化序列相互作用，可作為EGF/MAPK 信號傳導的雙峰調節劑。已經發現SPRY2 可以抑制癌細胞惡性行為的核心細胞功能，包括細胞增殖、分化、遷移和侵襲。還與甲基化、泛素化關系密切。最近，細胞表型在規模、分辨率和通量方面進行了大規模的改革，這歸因于成像細胞。

SPRY2 作為MAPK 信號通路的重要抑制因子，發揮著抑制細胞增殖、分化及遷移等生物學功能。研究發現，SPRY2 可作為一種抑癌基因分子，在多種癌癥中得以證實，如前列腺癌、乳腺癌、肝細胞癌和肺癌等腫瘤細胞中的表達被明顯抑制，從而使得RTKs 等信號通路逃避抑制而被過度激活，造成腫瘤細胞異常增殖，從而促進了腫瘤的發生和發展。當SPRY2 高表達時，能夠顯著地抑制細胞的增殖、生長和遷移。并且，SPRY2 還能夠明顯地促進細胞黏附、伸展。SPRY蛋白也被證實能夠與某些膜蛋白，如Cav-l，發生直接的相互作用，進而實現其抑制細胞增殖、遷移等生物學效應。

檢測細胞的表型，可以幫助了解相關基因、蛋白、藥物的機制，是科學研究不可或缺的手段。而SPRY2參與多種細胞表型，作為一種關鍵的mRNA，值得去挖掘深究。