內(nèi)生菌協(xié)同發(fā)酵對(duì)半夏多糖及其生物活性的影響

羅 偉，楊立軍，崔晨旭，王玉嬌，陳 瓊，王銳麗，葉 潤

（信陽農(nóng)林學(xué)院制藥工程學(xué)院，河南 信陽 464000）

半夏［Pinellia ternata（Thunb.）Breit.］又名地文、守田等，為天南星科植物半夏的干燥塊莖，是中國傳統(tǒng)中草藥，除西藏、新疆外，全國均有分布［1］，有燥濕化痰、降逆止嘔、生用消癤腫等藥理作用［2］。半夏在治療抑郁癥［3］、動(dòng)脈粥樣硬化［4］、慢性阻塞性肺疾病［5］以及癌癥等方面效果顯著；半夏化學(xué)成分豐富，多糖是其重要的化學(xué)成分，在抗腫瘤等方面具有較高的潛力［6］。

微生物發(fā)酵作為中藥材炮制的重要手段［7］，具有強(qiáng)大的生物轉(zhuǎn)化功能，不僅能夠產(chǎn)生新的次級(jí)代謝產(chǎn)物，還可以增強(qiáng)藥材原有特性或產(chǎn)生新的效果，較大地?cái)U(kuò)大了藥物的應(yīng)用范圍，并有助于其滿足臨床應(yīng)用的嚴(yán)格要求［8］。而傳統(tǒng)的中藥發(fā)酵存在菌種不純、僅對(duì)自然界的菌種進(jìn)行利用、難以有目的地定向改變藥物的性能等問題［9］。同時(shí)自然界中不占優(yōu)勢、生長條件要求比較嚴(yán)格的有益微生物，難以在自然條件下正常生長，較大地限制了微生物的作用。此外，有害菌的落入等也使微生物在藥物中的潛在效能沒有最大限度地發(fā)揮出來［10］。內(nèi)生菌是定植在植物內(nèi)部組織的微生物，存在于所有已知的植物物種中［11］，與宿主植物互惠共生，植物與內(nèi)生菌之間的緊密協(xié)同作用使內(nèi)生菌能夠合成各種潛在的次級(jí)代謝產(chǎn)物［12］。研究表明，法國梧桐中的內(nèi)生菌可以將白樺脂酸轉(zhuǎn)化為具有抗癌、抗HIV等藥理活性的樺木酮酸［13］。Kim 等［14］通過擔(dān)子菌發(fā)酵減少了漆樹莖皮中漆酚等過敏性物質(zhì)的含量，并在一定程度上保留了漆樹的抗氧化活性。此外，內(nèi)生菌在生產(chǎn)重要的藥用化合物如紫杉類、長春新堿、金絲桃素等毒素中也起著至關(guān)重要的作用［15，16］。

微生物發(fā)酵技術(shù)已廣泛應(yīng)用于各個(gè)領(lǐng)域，但鮮見半夏微生物發(fā)酵的相關(guān)報(bào)道。因此，本研究以半夏粉末為原料，協(xié)同兩株高產(chǎn)胞外多糖的半夏內(nèi)生真菌進(jìn)行固態(tài)發(fā)酵。以半夏多糖得率為指標(biāo)，通過單菌和混菌發(fā)酵、單因素試驗(yàn)與正交試驗(yàn)分別篩選出菌種的最適添加比例與最佳發(fā)酵條件；并對(duì)發(fā)酵前、后半夏多糖的得率，抗氧化、降血糖能力與電鏡結(jié)構(gòu)進(jìn)行比較分析，探討內(nèi)生菌協(xié)同發(fā)酵對(duì)半夏多糖生物活性與結(jié)構(gòu)的影響，以期為半夏多糖的高效利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

半夏塊莖購自信陽張仲景大藥房；土曲霉（Aspergillus terreus）與亞黑管菌（Bjerkandera adusta）為分離自半夏的高產(chǎn)胞外多糖內(nèi)生真菌。馬鈴薯葡萄糖瓊脂（PDA）：馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，瓊脂15～20 g，蒸餾水1 000 mL。馬鈴薯葡萄糖（PDB）：PDA 內(nèi)不添加瓊脂。α-葡萄糖苷酶、1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）、2，2′-聯(lián)氮-雙-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺（ABTS）購自合肥千盛生物科技有限公司；所有試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

WFJ-15 型超微粉碎機(jī)，江蘇康臣干燥工程有限公司；GT10-1 型高速臺(tái)式離心機(jī)，北京時(shí)代北利離心機(jī)有限公司；雙層恒溫振蕩培養(yǎng)箱，上海知楚儀器有限公司；1510 全自動(dòng)酶標(biāo)儀，美國賽默飛世爾科技公司；立式壓力蒸汽滅菌鍋，上海三申醫(yī)療器械有限公司；SW-CJ-2F 型落地式潔凈工作臺(tái)，上海力辰邦西儀器科技有限公司。

1.3 菌種活化

PDA 與PDB 培養(yǎng)基在220 Pa、121 ℃條件下高壓滅菌15 min。取土曲霉、亞黑管菌，在無菌超凈工作臺(tái)中將菌株接種在PDA 培養(yǎng)基中，28 ℃培養(yǎng)5 d后得活化菌株。挑取菌絲體于PDB中，28 ℃、120 r/min條件下振蕩培養(yǎng)5～7 d，待菌種擴(kuò)大培養(yǎng)至生長指數(shù)期后即得種子液。

1.4 發(fā)酵菌株篩選

取干燥粉碎后過80 目篩的半夏粉末，設(shè)置裝料量為每250 mL 15.0 g，121 ℃滅菌15 min，當(dāng)發(fā)酵底物溫度降至室溫時(shí)分別接入菌株種子液，固定總接種量為8%，菌株比例如下，單菌；土曲霉∶亞黑管菌按（m/m）1∶1、1∶2、2∶1、1∶3、3∶1 混菌；不接種的作為空白對(duì)照。28 ℃恒溫發(fā)酵120 h，發(fā)酵結(jié)束后將發(fā)酵物二次滅菌從而終止發(fā)酵的進(jìn)行，測定多糖含量，以樣品多糖得率為指標(biāo)篩選出最佳發(fā)酵菌種。

1.5 多糖含量測定

1.5.1 多糖提取 參考師景雙等［17］的方法，稍作修改如下，稱取樣品按料液比1∶10（g/mL）加無水乙醇，90 ℃水浴浸提2 h，去油、抽濾、收集固體殘留物，晾干稱重備用。取去油后固體按比例加水，加熱套回流提取，提取后以4 000 r/min 離心15 min 收集上清液，再旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮溶液至1/5，加入Sevage 試劑（三氯甲烷∶正丁醇=4∶1）混合振搖，4 000 r/min 離心15 min 分液除去蛋白質(zhì)，取上清液加入3 倍無水乙醇后4 ℃靜置過夜，離心后收集沉淀即為多糖樣品。

1.5.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備 采用苯酚-硫酸法［18］測定多糖含量，以葡萄糖含量為橫坐標(biāo)（x）、吸光度為縱坐標(biāo)（y），建立葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線方程y=23.749x+4.107 5，R2=0.995 1。

1.6 單因素試驗(yàn)

用電子天平稱取15 g 半夏粉末，121 ℃滅菌15 min 后制得發(fā)酵底物，選擇發(fā)酵溫度、發(fā)酵時(shí)間和接種量3 個(gè)因素進(jìn)行單因素試驗(yàn)，每個(gè)因素研究5個(gè)水平，發(fā)酵溫度分別為25、28、31、34、37 ℃；發(fā)酵時(shí)間分別為100、110、120、130、140 h；接種量分別為6%、8%、10%、12%、14%。

1.7 正交試驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，分別選取發(fā)酵溫度、發(fā)酵時(shí)間與接種量進(jìn)行三因素三水平的正交試驗(yàn)，試驗(yàn)設(shè)計(jì)見表1。

表1 正交試驗(yàn)因素與水平設(shè)計(jì)

1.8 抗氧化能力測定

1.8.1 DPPH 自由基清除能力測定 參考劉娜等［19］的方法測定DPPH 自由基清除能力。

1.8.2 ABTS 自由基清除能力測定 參考段鴻斌等［20］的方法測定ABTS 自由基清除能力。

1.8.3 羥基自由基清除能力測定 采用羥基自由基清除法［21］進(jìn)行測定。具體計(jì)算式如下。

式中，A0為蒸溜水代替樣品的吸光度；Ai為樣品吸光度；Aj在DPPH、ABTS、羥基自由基清除能力測定中分別表示無水乙醇代替DPPH 應(yīng)用液的吸光度、蒸餾水代替ABTS 工作液的吸光度、蒸餾水代替FeSO4溶液的吸光度。

1.9 降血糖能力測定

參考Dong 等［22］的PNPG 法，并稍作修改，以阿卡波糖作為陽性對(duì)照，將樣品和阿卡波糖分別配置成質(zhì)量濃度為0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 mg/mL 的溶液。取10 μL 各樣品溶液與45 μL 5 U/mL α-葡萄糖苷酶磷酸鹽溶液，振蕩混勻后置于37 ℃培養(yǎng)箱，使其反應(yīng)10 min。然后加入35 μL 5 mmol/L 4-硝基苯-α-D-吡喃葡萄糖苷（PNPG）溶液啟動(dòng)反應(yīng)，并置于37 ℃培養(yǎng)箱孵育30 min，加入100 μL 碳酸鈉溶液終止反應(yīng)，于波長405 nm 處測定其吸光度。具體計(jì)算式如下。

式中，B0為磷酸緩沖溶液代替樣品的吸光度；Bi為樣品的吸光度；Bj為磷酸緩沖溶液代替α-葡萄糖苷酶溶液的吸光度。

1.10 表面形態(tài)觀察

將樣品固定在導(dǎo)電膠上，鍍金后，利用掃描電鏡對(duì)樣品的外觀形貌進(jìn)行觀察，并選擇放大倍數(shù)為5 000 倍時(shí)樣品的表面結(jié)構(gòu)進(jìn)行對(duì)比分析。

1.11 數(shù)據(jù)分析

每組試驗(yàn)重復(fù)3 次，分別使用SPSS 26.0、Origin 2018 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析與繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 發(fā)酵菌株篩選結(jié)果

單菌發(fā)酵與混菌發(fā)酵對(duì)半夏多糖得率的影響如圖1 所示，微生物發(fā)酵技術(shù)能夠提高發(fā)酵產(chǎn)物中功能性組分的含量［23］，如可溶性膳食纖維、多酚化合物、蛋白質(zhì)與多糖等，是一種綠色且環(huán)保的生物轉(zhuǎn)化手段；楊金梅等［24］通過對(duì)粉葛的發(fā)酵使粉葛中大豆苷元、大豆苷、葛根素、總異黃酮、可溶性多糖和總淀粉含量多數(shù)成倍增加；謝瑾［25］通過對(duì)干基草石蠶進(jìn)行發(fā)酵使水蘇糖的純度得到較大程度的提高。本研究中，相較于未進(jìn)行發(fā)酵時(shí)半夏多糖得率（10.83%），經(jīng)過發(fā)酵后半夏粉末的多糖得率均得到不同程度的提高。其中，第5 種發(fā)酵類型（土曲霉∶亞黑管菌=2∶1）的半夏多糖得率最高，為16.58%，因此，選擇土曲霉∶亞黑管菌為2∶1 對(duì)半夏進(jìn)行發(fā)酵。

圖1 單菌發(fā)酵與混菌發(fā)酵對(duì)半夏多糖得率的影響

2.2 單因素試驗(yàn)結(jié)果與分析

2.2.1 發(fā)酵溫度對(duì)協(xié)同發(fā)酵半夏多糖含量的影響 溫度是影響菌株生長和代謝的重要因素。Lin 等［26］的研究表明，最佳溫度可以促進(jìn)菌株更旺盛的生長，使活菌數(shù)量更多，酶活性更高，從而保證更好的發(fā)酵質(zhì)量。如圖2 所示，發(fā)酵溫度對(duì)半夏多糖得率的影響較大，當(dāng)發(fā)酵溫度為25～31 ℃時(shí)，半夏多糖得率呈上升趨勢；當(dāng)發(fā)酵溫度為31～37 ℃時(shí)，半夏多糖得率呈下降趨勢；在31 ℃時(shí)半夏多糖得率達(dá)到最大，為18.27%。綜上，選取28、31、34 ℃進(jìn)行正交試驗(yàn)。

圖2 發(fā)酵溫度對(duì)半夏多糖得率的影響

2.2.2 發(fā)酵時(shí)間對(duì)協(xié)同發(fā)酵半夏多糖含量的影響 發(fā)酵時(shí)間是決定發(fā)酵質(zhì)量的重要因素。在發(fā)酵過程中，隨著發(fā)酵時(shí)間的延長，微生物通過消耗營養(yǎng)物質(zhì)不斷繁殖，導(dǎo)致藥物殘留的有效成分和營養(yǎng)價(jià)值發(fā)生變化［27］。如圖3 所示，隨著發(fā)酵時(shí)間的延長，半夏多糖的得率先上升后下降，120 h 時(shí)達(dá)到最大，為16.58%；內(nèi)生菌以半夏粉末為基質(zhì)進(jìn)行發(fā)酵，隨著發(fā)酵時(shí)間延長，發(fā)酵基質(zhì)中有限的營養(yǎng)物質(zhì)被大量消耗，無法供應(yīng)菌種的正常生長和代謝，可能會(huì)消耗發(fā)酵產(chǎn)生的半夏多糖，從而使多糖含量下降。綜上，選取發(fā)酵時(shí)間110、120、130 h 進(jìn)行正交試驗(yàn)。

圖3 發(fā)酵時(shí)間對(duì)半夏多糖得率的影響

2.2.3 接種量對(duì)協(xié)同發(fā)酵半夏多糖含量的影響 接種量與發(fā)酵基質(zhì)中菌種的繁殖速度密切相關(guān)，適宜的接種量不僅可以縮短發(fā)酵時(shí)間，提高發(fā)酵速率，而且對(duì)發(fā)酵基質(zhì)的狀態(tài)及營養(yǎng)物質(zhì)含量存在調(diào)控作用［24］。接種量對(duì)半夏多糖得率的影響如圖4 所示，隨著接種量的增加，半夏多糖得率先緩慢上升，在接種量為12%時(shí)達(dá)到最大；接種量大于12%后急劇下降。綜上，選取接種量10%、12%、14%進(jìn)行正交試驗(yàn)。

圖4 接種量對(duì)半夏多糖得率的影響

2.3 正交試驗(yàn)結(jié)果與分析

正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)結(jié)果見表2，方差分析結(jié)果見表3。R代表極差，極差越大，則表明該因素對(duì)多糖得率的影響越大。表3 的F是兩個(gè)均方的比值，F(xiàn)越大，說明此項(xiàng)對(duì)多糖得率的影響越顯著，則影響多糖得率的主次因素發(fā)酵時(shí)間（B）＞發(fā)酵溫度（A）＞接種量（C）。半夏協(xié)同發(fā)酵的最佳發(fā)酵條件為A2B1C2，即發(fā)酵溫度31 ℃、發(fā)酵時(shí)間110 h、接種量12%。按上述發(fā)酵條件進(jìn)行3 次重復(fù)驗(yàn)證試驗(yàn)，最終多糖得率為21.76%,相較于未發(fā)酵得到顯著提高（P＜0.05）。

表2 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)結(jié)果

表3 正交試驗(yàn)方差分析結(jié)果

2.4 發(fā)酵前、后半夏多糖抗氧化能力的變化

發(fā)酵前、后半夏多糖對(duì)DPPH 自由基、羥基自由基、ABTS 自由基的清除能力如圖5 所示，可以看出，在一定范圍內(nèi)，無論是發(fā)酵前還是發(fā)酵后，半夏多糖對(duì)DPPH 自由基、ABTS 自由基、羥基自由基均具有一定的清除能力，且清除率隨著濃度的增加均呈上升趨勢，雖然半夏多糖的抗氧化能力均不及維生素C，但發(fā)酵后半夏多糖的抗氧化能力明顯大于發(fā)酵前半夏多糖的抗氧化能力。發(fā)酵后半夏多糖對(duì)3種自由基的半數(shù)清除濃度如表4 所示，其對(duì)DPPH自由基的清除作用最強(qiáng)，對(duì)ABTS 自由基的清除作用次之，對(duì)羥基自由基的清除作用最弱；當(dāng)發(fā)酵后半夏多糖濃度為8 mg/mL 時(shí)，其對(duì)DPPH 自由基、羥基自由基、ABTS 自由基的清除率分別為92.28%、79.12%、83.95%。微生物發(fā)酵可以使底物的抗氧化活性得到提升，這與董佳萍等［28］的研究結(jié)果一致。

表4 發(fā)酵前、后半夏多糖與維生素C 對(duì)DPPH、ABTS、羥基自由基的半數(shù)清除濃度（IC50） （單位：mg/mL）

2.5 抑制α-葡萄糖苷酶活性結(jié)果與分析

α-葡萄糖苷酶作為一種重要的碳水化合物水解酶，在將低聚糖和二糖轉(zhuǎn)化為葡萄糖，從而降低血糖的過程中起著關(guān)鍵作用［22］。由圖6 可知，在0.2～1.2 mg/mL 濃度內(nèi)，發(fā)酵前、后半夏多糖對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制活性均呈量效關(guān)系，發(fā)酵后的半夏多糖對(duì)α-葡萄糖苷酶的半數(shù)清除濃度為0.368 mg/mL，低于未發(fā)酵時(shí)半夏多糖的半數(shù)清除濃度為0.661 mg/mL。當(dāng)濃度為1.2 mg/mL 時(shí)，發(fā)酵前、后半夏多糖對(duì)α-葡萄糖苷酶的清除率分別達(dá)70.57%、89.30%，發(fā)酵后的半夏多糖對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制效果雖然弱于阿卡波糖，但得到明顯增加，說明發(fā)酵后的半夏多糖具有良好的體外降血糖能力。

圖6 發(fā)酵前、后半夏多糖對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制能力

2.6 掃描電鏡結(jié)果

對(duì)發(fā)酵前、后的半夏多糖分別進(jìn)行掃描電子顯微鏡觀察，放大5 000 倍后的觀察結(jié)果如圖7 所示。發(fā)酵后半夏多糖的微觀結(jié)構(gòu)呈明顯孔絮狀，邊緣不整，內(nèi)部孔隙多，不平整；而發(fā)酵前半夏多糖的微觀結(jié)構(gòu)呈片塊狀，整體形貌較發(fā)酵后更規(guī)則，表面較平整光滑。發(fā)酵后半夏多糖呈碎片孔絮狀結(jié)構(gòu)，可能是由于在進(jìn)行發(fā)酵時(shí)，多糖結(jié)構(gòu)被降解成小分子或者發(fā)酵導(dǎo)致分子質(zhì)量與構(gòu)象發(fā)生變化。

圖7 發(fā)酵前、后半夏多糖的掃描電鏡觀察

3 小結(jié)與討論

通過內(nèi)生菌協(xié)同發(fā)酵可以提高半夏多糖的得率與生物活性，最適添加比例為土曲霉∶亞黑管菌=2∶1；通過單因素試驗(yàn)與正交試驗(yàn)得出的最佳發(fā)酵條件為發(fā)酵溫度31 ℃、發(fā)酵時(shí)間110 h、接種量12%，最終半夏多糖的得率為21.76%，相較于未發(fā)酵時(shí)的10.83%得到顯著提高（P＜0.05）。降血糖與抗氧化試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，發(fā)酵后的半夏多糖抑制α-葡萄糖苷酶的IC50減小了0.293 mg/mL；對(duì)DPPH 自由基、ABTS 自由基、羥基自由基的IC50分別減小了0.137、0.231、0.218 mg/mL；其中，它對(duì)3 種自由基的清除能力從大到小依次為DPPH 自由基、ABTS 自由基、羥基自由基。這表明，采用植物的內(nèi)生真菌進(jìn)行發(fā)酵可以有效提高植物的生物活性，這與Kim 等［14］利用內(nèi)生菌進(jìn)行協(xié)同發(fā)酵的結(jié)果一致。半夏中多糖得率與活性得到有效提高，為半夏多糖的深入研究以及相關(guān)功能性產(chǎn)品的開發(fā)與利用奠定了基礎(chǔ)，促進(jìn)了半夏產(chǎn)業(yè)的發(fā)展，同時(shí)也為內(nèi)生菌對(duì)藥用植物的生物轉(zhuǎn)化作用提供了理論依據(jù)。本研究在對(duì)半夏發(fā)酵的研究中，僅初步研究了半夏與兩株胞外多糖菌株協(xié)同發(fā)酵后其多糖的變化，并未對(duì)多糖主要活性成分及其他活性進(jìn)行深入的對(duì)比分析。因此，后續(xù)將采用紅外光譜、氣質(zhì)等技術(shù)對(duì)發(fā)酵前、后半夏多糖的結(jié)構(gòu)組成進(jìn)行分析；并對(duì)發(fā)酵后半夏多糖的抑菌能力進(jìn)行測定。