小鼠體外受精代孕鼠體重和飼料對其生產的影響

王 倩，劉亮亮

（華中科技大學同濟醫學院附屬同濟醫院科研處實驗動物中心，武漢 430000）

體外受精（In vitro fertilization，IVF）和胚胎移植是一項重要的輔助生殖技術。生物凈化是利用受精卵透明帶的屏障作用，結合體外受精和胚胎移植技術，可以去除目的品系小鼠所感染的細菌、病毒、體內外寄生蟲等病原體，將小鼠微生物等級提升至SPF 級及以上，并有效減少或阻止病原體通過一個活體小鼠傳染給飼養在屏障設施內的其他小鼠［1，2］。因此，科研人員堅持不懈研究可以提高體外受精率、胚胎發育率以及高產仔率的方法。洪勝輝等［3］研究發現在小鼠體外受精液（HTF）中添加GSH 1 mmol/L 時，體外受精效果最好。張景鋒等［4］研究發現帶顆粒的卵母細胞和不帶顆粒的卵母細胞的最佳精卵孵育時間不同。張長勇等［5］研究發現妊娠期母鼠添加營養補充劑能夠增加仔鼠的體質量，利于仔鼠的生長發育。也有研究表明母鼠年齡也會影響其妊娠結果和仔鼠行為學［6］。但是對于胚胎移植時，代孕母鼠自身體重和營養狀態對后續妊娠率和產仔率的影響卻少有研究。本研究通過比較在移植相同數量同等質量胚胎的情況下，不同體重范圍代孕母鼠的妊娠率、產仔率的差異來探尋最佳狀態的代孕母鼠；并比較移植后給孕鼠喂食不同飼料對其產崽造成的影響，以期為優化小鼠生物凈化和擴繁提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗動物

本研究所使用試驗動物為6～10 周SPF 級ICR雌性小鼠，體重分為22～27 g、28～33 g、34～39 g 三組。3～4 周C57BL/6J 雌性小鼠和三月齡C57BL/6J雄性小鼠。以上小鼠均購于上海集萃藥康生物有限公司。動物飼養在華中科技大學同濟醫學院附屬同濟醫院實驗動物中心SPF 級屏障環境中，小鼠生長環境維持在溫度23～26 ℃，濕度40%～70%，自動光控（白晝黑夜各12 h），小鼠自由飲食飲水。小鼠在到達該中心后均喂養繁殖飼料，代孕ICR 母鼠在接受移植胚胎手術之后再進行分組飼養，一組進行繁殖飼料喂養，一組進行維持飼料喂養。

1.2 主要試劑和儀器

孕馬血清促性腺激素（PMSG）購于北京索萊寶生物科技有限公司，人絨毛膜促性腺激素（HCG，PRS-HOR-250-2.5 mg）購于Prospectbio 博思配生物科技有限公司。精子體外獲能液（HTF，KYD-008-02）購于Cosmo Bio 生物公司，卵母細胞體外成熟培養液（M2MR-015）和礦物油（M8410，500 mL）購于Sigma-Aldrich 西格瑪奧德里奇。小鼠麻醉劑三溴乙醇（M2910，10 mL）購于南京愛貝生物科技有限公司。小鼠繁殖飼料和維持飼料均購于武漢萬千佳興生物科技有限公司。細胞培養皿購于Corning 康寧公司。細胞培養箱（賽默飛世兒Thermo Fisher），體視顯微鏡（Leica 徠卡），倒置顯微鏡（Olympus 公司）。

1.3 體外受精

1.3.1 小鼠卵子超排和取卵 將3～4 周C57BL/6J雌性小鼠腹腔注射PMSG，5 IU/只。間隔48 h 后注射HCG，5 IU/只［7］。在注射激素后15 h 取卵，采用頸椎脫臼法處死小鼠，剪取小鼠輸卵管，在卵母細胞體外成熟培養液中清洗2 次后用精細鑷劃開壺腹部，將卵母細胞釋放入提前6 h 在細胞培養箱預孵育的HTF 培養液中。每微升HTF 為80～100 個卵。

1.3.2 小鼠精子采集 將3 月齡C57BL/6J雄性小鼠用頸椎脫臼法處死，剪取小鼠附睪，在M2清洗2 遍，用精細鑷劃開附睪尾，挑取1 滴精液放入提前孵育過夜的HTF 培養液中，獲能約1 h。

1.3.3 小鼠體外受精 在小鼠精子獲能后，在顯微鏡下觀察精子活力和濃度，采用精子計數板計數，在獲能滴邊緣吸取適量精子加入上述孵育的未受精小鼠卵子中，使其最終精子濃度為1×106個/mL［8］。

在受精6 h 以后，用預先拉制好的玻璃電極吸取受精卵在干凈的已預孵的HTF 液滴中清洗2 次，放置于細胞培養箱中培養過夜。

1.4 胚胎移植

1.4.1 假孕鼠的準備 分別將挑選的3 個體重范圍（22～27 g、28～33 g、34～39 g）處于發情周期的SPF級ICR 雌性小鼠在胚胎移植前1 d 下午5：00 左右與結扎的ICR 雄鼠合籠。第2 天早上8：00 左右將有陰道栓的雌鼠挑出，用于胚胎移植試驗［9］。

1.4.2 雙細胞受精卵的移植 將有陰道栓的代孕母鼠稱重，按照每10 g 體重腹腔注射0.2 mL 三溴乙醇麻醉劑。待小鼠完全麻醉失去知覺后，用小鼠專用剃毛器剃去小鼠右側腎部靠背部的毛，75%乙醇消毒后剪開，用鑷子小心牽引出該側卵巢脂肪墊和輸卵管，找到輸卵管膨大傘口，用拉制的移卵針連接上口吸管吸取分裂均一的雙細胞受精卵，插入代孕鼠輸卵管傘口，吹入13 顆雙細胞至輸卵管壺腹部。將卵巢、子宮等復位，縫合后消毒。將小鼠放在37 ℃熱臺待其蘇醒。

1.5 已接受移植的小鼠飼養

每組體重范圍的小鼠再分為2 組，一組飼養繁殖飼料，一組飼養普通維持飼料，其他飼養條件相同。

將已經接受過胚胎移植手術的小鼠單籠飼養，待小鼠生產后，統計各組代孕鼠妊娠率和窩產崽數，妊娠率=妊娠雌鼠數/移植總雌鼠數×100%。

1.6 數據分析與統計

采用SPSS 25.0 軟件進行數據分析。采用單因素方差分析來分析同組體重下不同飼料是否對其生產產生影響。采用t檢驗對不同體重組間進行差異顯著性分析，P＜0.05 表示差異顯著。計量資料均使用平均數±標準差表示。

2 結果與分析

2.1 不同飼料對代孕鼠生產的影響

在給不同體重組的代孕鼠移植相同數量、質量的胚胎后，將每組體重再分為2 組分別飼養繁殖飼料和維持飼料。如圖1 所示，在相同體重區間內，繁殖飼料組和維持飼料組的窩產崽數并無顯著差異（P＞0.05）。結果表明，在代孕母鼠處于相同的體重區間內時，代孕鼠只在妊娠周期短期內的營養差異對其胚胎發育和生產影響不顯著。

圖1 繁殖飼料組和維持飼料組窩產崽數

2.2 代孕母鼠體重對其生產的影響

由表1 可知，在接受相同數量和相同質量的胚胎移植后，體重為22～27g 代孕母鼠組的窩產崽數為（3.65±2.81）只，以及其妊娠率均顯著小于28～33 g、34～39 g 代孕母鼠組（P＜0.05）。22～27 g 代孕母鼠組妊娠率為65%±49%，28～33 g 代孕母鼠組的妊娠率為95%±22%，34～39 g 代孕母鼠組的妊娠率為90%±31%。但28～33 g 與34～39 g 代孕母鼠組的窩產崽數以及妊娠率均無顯著差異（P＞0.05）。

表1 各組窩產崽數和妊娠率比較

3 小結與討論

生物凈化技術已經成為預防小鼠引入污染的風險、確保設施生物安全的重要手段之一［10］。研究表明，移植胚胎的受精率和移植的胚胎數量會影響胚胎移植的產仔率和窩產仔數量［11］。胚胎的品系和背景也會對小鼠胚胎移植后的產仔率造成影響［12］。因此，本研究在保證胚胎品系、質量均相同的情況下，分析移植時代孕母鼠的體重對其產崽和生產情況的影響，結果表明，28～33 g 代孕母鼠組和34～39 g 代孕母鼠組的移植生產窩產崽數顯著高于22～27 g 組，并且其妊娠率也相對較高。但是在34～39 g 代孕母鼠組生產后，發現偶爾出現鼠崽會被大體重母鼠壓死的情況，導致小鼠凈化和擴繁效率下降。因此，綜合以上結果考慮，在小鼠體外受精時，代孕母鼠體重控制在28～33 g 時，生產效率最高。但是本研究對代孕母鼠的體重分組還不夠細致，生產效率最高的母鼠體重還需要后續繼續研究。

有研究表示輔酶Q10 聯合生長激素用于IVF 患者備孕期營養補充效果良好，能顯著改善IVF-ET結局，提高妊娠成功率［13］。不同的商品飼料對小鼠繁殖也會造成不同影響［14，15］。母鼠在產仔后也會因為營養問題影響其泌乳，泌乳不足則會出現食仔的現象，母鼠的營養狀態會影響其生產［16］。但是本研究發現，只是在妊娠內的飼料差異對其生產的影響并不顯著，不同飼料組間的窩產崽數并無顯著差異，原因可能是因為小鼠在進行移植手術前均喂養相同的繁殖飼料，如果只在妊娠期短期內飼養不同的飼料可能對其生產影響不大。本研究只針對了一個廠家的飼料進行了短期研究，至于長期喂食不同廠家的飼料試驗結果是否會出現差異，以及具體是何種成分對其造成影響還需要后續深入研究。

綜上所述，本試驗探究了在體外受精的生物凈化中，不同體重區間的代孕母鼠對其生產效率的影響，發現28～33 g 組代孕母鼠的生產效率最高，最適宜用作胚胎移植的代孕母鼠。并且本研究也發現只在妊娠期喂食不同飼料，繁殖飼料與維持飼料對其生產影響差異不顯著。通過研究在小鼠體外受精后，代孕母鼠體重及其攝入飼料類型對其生產效率的影響，為小鼠凈化系統的優化提供了參考。

致謝：感謝華中科技大學同濟醫學院附屬同濟醫院科研處實驗動物中心余其林老師對試驗的指導和支持。