魚油來源的棕櫚油酸對神經(jīng)膠質(zhì)細胞的激活研究

楊衍卓，郁清婷，項 璐，楊最素，袁法磊

（1.浙江海洋大學食品與藥學學院，浙江 舟山 316022；2.鄂爾多斯市東勝區(qū)市場監(jiān)督管理局，內(nèi)蒙古 鄂爾多斯 017000）

棕櫚酸（Palmitic acid，PA）是人體中最豐富的脂肪酸，在正常血液中PA 濃度為（122±48）μmol/L［1］。PA 在肥胖、非酒精性脂肪肝、動脈粥樣硬化等多種代謝性疾病中高表達，有研究顯示阿爾茨海默癥患者大腦皮層的PA 水平顯著升高［2］。棕櫚油酸（Palmitoleic acid，POA）是一種十六碳的Omega-7 單不飽和脂肪酸。PA 在硬脂酰輔酶A 去飽和酶1 的作用下能夠轉(zhuǎn)化為POA［3］。正常人體血液中的POA濃度維持在50 μmol/L 以內(nèi)［4］。PA 和POA 的生理功能均不明確，而PA 被認為是一種有害飽和脂肪酸［5］。2008 年，Cao 等［6］研究發(fā)現(xiàn)POA 是一種調(diào)節(jié)胰島素作用和肝臟代謝的脂質(zhì)因子（Lipokine）。后續(xù)研究顯示POA 作為膳食補充劑能夠有效降低超敏C 反應蛋白而具有抗炎作用，同時能夠治療胰島素抵抗［7，8］。與POA 相關的膳食補充劑產(chǎn)品主要位于歐美市場，其原料來自沙棘果油或魚油，沙棘果油中含天然甘油酯型的POA，占總脂肪酸含量的30%～40%，但是沙棘果油來源的POA 原料價格高、產(chǎn)量少、受采摘季節(jié)限制。魚油來源的POA 是Omega-3 精制魚油的副產(chǎn)物，每生產(chǎn)1 t治療高血脂癥的處方藥Lovaza，產(chǎn)生1 t POA 含量約為15% 的生物柴油。此類生物柴油大部分都被當作清潔能源燒掉，因此魚油中的POA 有很大的市場開發(fā)價值。高純度的POA 產(chǎn)品只有色譜標準品，售價高且產(chǎn)量有限。POA 因為與PA 分子量接近，常規(guī)的分離手段如分子蒸餾等無法有效分離，因此，魚油POA 產(chǎn)品需要多次尿素包合法才能將含量提高至50%。除了制備級液相色譜可制取高純度POA 作為標準品外，還沒有工業(yè)化的方法能夠?qū)OA 含量提高至60%。

下丘腦主要功能是調(diào)控體溫、體液平衡以及代謝［9］。小膠質(zhì)細胞是位于大腦中的一類巨噬細胞，主要功能為吞噬凋亡或者壞死后形成的細胞碎片，同時小膠質(zhì)細胞本身被激活或損傷死亡后能夠釋放炎癥因子，對周圍健康組織起到預警作用［10］。小膠質(zhì)細胞通常表達Iba-1、CD11b、CD68 等蛋白，其中Iba-1 是較為特異的小膠質(zhì)細胞蛋白，可以通過Iba-1 的表達量來判斷小膠質(zhì)細胞的激活［11］。小膠質(zhì)細胞在受損后具有很強的自我更新能力，用特異性的抑制劑清除99%小膠質(zhì)細胞后能在一周時間內(nèi)全部恢復［12］。星形膠質(zhì)細胞接收激活或者死亡后的小膠質(zhì)細胞釋放的信號成為反應性星形膠質(zhì)細胞，GFAP 是使用最廣的區(qū)分反應性星形膠質(zhì)細胞的蛋白［13］。最新研究表明，神經(jīng)元是被激活后的反應性星形膠質(zhì)細胞通過分泌長鏈飽和脂肪酸所殺死［14］，這提示在研究涉及神經(jīng)元死亡的退行性疾病如阿爾茨海默癥和飲食相關引起的下丘腦代謝紊亂時，小膠質(zhì)細胞被激活的因素分析至關重要。高脂飲食會激活下丘腦小膠質(zhì)細胞，引起一系列炎癥性反應包括下丘腦功能的失調(diào)。高脂飲食同時含有大量飽和脂肪酸如PA 和不飽和脂肪酸如油酸和POA，單一脂肪酸成分的功效和生理作用很難通過高脂飲食來研究，因此高脂飲食引起的下丘腦功能的失調(diào)機制尚不明確。

本研究通過體外細胞模型單獨分析PA 和POA對小膠質(zhì)細胞的損傷，然后制備高純度POA 用于動物試驗，并通過與PA 對比來研究POA 對神經(jīng)膠質(zhì)細胞的激活作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗動物 SPF 級6～8 周齡ICR 雄性小鼠24只，體重（30.0±1.5）g，來源于杭州子源實驗動物科技有限公司［SCXK（浙）2019-0004］。動物飼養(yǎng)以及試驗在浙江海洋大學SPF 動物房［SYXK（浙）2019-0031］。本研究經(jīng)浙江海洋大學實驗動物福利與倫理委員會批準（2021-026），所有動物試驗均符合3R 指導原則。

1.1.2 細胞系 小鼠BV-2 小膠質(zhì)細胞（湖南豐暉生物科技有限公司）；Omega-7 魚油膠囊（美國Life Extension）。

1.1.3 試劑與設備DMEM 高糖培養(yǎng)基（PM150210）；0.25%胰蛋白酶（PB180228）；青霉素-鏈霉素溶液（PB180120）均由武漢普諾賽生命科技有限公司購買；無脂肪酸，低內(nèi)毒素-牛血清白蛋白（BSA，AS33654，浙江聯(lián)碩創(chuàng)先生物科技有限公司）；BI 胎牛血清（04-001-1ACS，以色列Biological Industries）；棕櫚酸鈉（S161420，上海阿拉丁生化科技股份有限公司）；棕櫚油酸（P111106，上海阿拉丁生化科技股份有限公司）；CCK-8 細胞增殖與毒性檢測試劑盒（#K1018，美國APE x BIO 生物科技有限公司）；碘化丙啶（PI）試劑盒（C1075，上海碧云天生物技術有限公司）；TUNEL 凋亡檢測試劑盒（MK1027，武漢博士德生物工程有限公司）；石蠟切片機（RM2135，德國徠卡公司）

1.2 方法

1.2.1 脂肪酸與BSA 復合物溶液的配制 在70 ℃水浴制備溶于蒸餾水的50 mmol/L PA 儲備液，200 mmol/L 的POA 儲備液用乙醇配制。然后將PA和POA 儲備液分別稀釋至2 mmol/L 和1 mmol/L，加入到37 ℃預熱的BSA 溶液中（控制脂肪酸與BSA 摩爾比為5∶1），并在37 ℃下孵育1 h，使脂肪酸與BSA充分結合。脂肪酸-BSA 復合物溶液用DMEM 稀釋并通過0.22 μm 濾膜過濾除菌。

1.2.2 細胞活力測定 細胞以2×104個/孔密度接種于96 孔板，待細胞貼壁完全，用含有BSA（對照），0、50、100、200、300 μmol/L PA，或0、50、100、200、400、500 μmol/L POA 的無血清培養(yǎng)基代替原培養(yǎng)基處理24 h。然后每孔加入占培養(yǎng)基10%體積的CCK-8 溶液37 ℃孵育2 h，用酶標儀（SpectraMa，美國Molecular Devices）檢測波長490 nm 處的吸光值。

1.2.3 PI與TUNEL 檢測 小鼠BV-2 細胞系在條件為37 ℃和5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。完全培養(yǎng)基為高糖DMEM 培養(yǎng)基添加10%胎牛血清和1%青霉素-鏈霉素溶液。細胞鋪滿24 孔培養(yǎng)板70%～80%時進行給藥處理。用含有BSA（對照）、PA（200 μmol/L）或POA（200 μmol/L）的無血清培養(yǎng)基代替原培養(yǎng)基處理4 h 后進行PI 染色。用與上述相同的處理方式處理細胞24 h 后按試劑盒說明書進行TUNEL 檢測。PI 染色以及TUNEL 染色后進行DAPI 復染細胞核，在熒光顯微鏡（OLYMPUS BX41，日本奧林巴斯株式會社）下觀察拍照。

1.2.4 負載結晶尿素硅膠柱分離純化魚油膠囊中棕櫚油酸乙酯 負載結晶尿素硅膠柱的制備：稱取40 g 的尿素溶解在95%乙醇中，在攪拌下加入60 g 200 目的硅膠充分混合后，真空旋轉(zhuǎn)蒸干溶劑，得到柱層析固定相。稱取一定量柱層析固定相放入石油醚中，濕法裝入玻璃管柱（20 mm×600 mm）中，制備成負載結晶尿素硅膠色譜柱。

以石油醚和乙酸乙酯（V/V）（300∶1）為洗脫劑，取魚油樣品加洗脫劑溶解后上樣3 mL，控制流速1 mL/min 洗脫，每10 mL 收集一個洗脫份。對洗脫份進行氣相色譜（安捷倫-7890A，美國安捷倫科技公司）分析，用面積歸一化法確定棕櫚油酸的含量。1.2.5 動物免疫組織化學染色 將ICR 小鼠隨機分成3 組，每組8 只，在正常飲食的情況下給予BSA（對照）、PA（300 mg/kg）、POA（300 mg/kg）灌胃持續(xù)2周。小鼠經(jīng)心臟灌注鹽水和多聚甲醛后取腦，石蠟包埋后切片。小鼠腦組織石蠟切片經(jīng)脫蠟和復水后，使用檸檬酸鈉-EDTA 抗原修復液（P0086，上海碧云天生物技術有限公司）抗原修復后，分別添加如下一抗：Iba-1 抗體（019-19741，日本和光純藥工業(yè)株式會社）；Ki67 抗體（12202T，美國Cell Signaling Technology）；GFAP 抗體［D262817，生工生物工程（上海）股份有限公司］；髓鞘堿性蛋白（MBP）抗體（78896，美國Cell Signaling Technology）。室溫孵育2 h，PBS 洗去一抗后，加入辣根過氧化物酶偶聯(lián)多聚物二抗（PR30009，武漢三鷹生物技術有限公司）室溫孵育1 h 后，二氨基聯(lián)苯胺（DAB）顯色，水性封片劑封片后在光學顯微鏡下拍照獲取圖片。

1.2.6 統(tǒng)計學方法 免疫組織化學染色結果采用Image J 軟件進行分析。免疫組織化學染色定量分析采用陽性細胞或陽性區(qū)域與總區(qū)域像素比值為定量依據(jù)。試驗數(shù)據(jù)均表示為平均數(shù)±標準差，有至少3 次平行重復試驗，數(shù)據(jù)采用GraphPad Prism 9軟件進行單因素方差分析，并采用Tukey’s 多重檢驗進行組間顯著性分析，P＜0.05 表示具有統(tǒng)計學差異。

2 結果與分析

2.1 POA 給藥濃度小于200 μmol/L 未造成小膠質(zhì)細胞死亡，而PA 引發(fā)大量焦亡和少量凋亡

PA 濃度在100 μmol/L 以下時對BV-2 細胞活力無明顯影響。150、200、300 μmol/L PA 處理細胞24 h細胞活力下降19.3%、50.0%、70.0%（圖1a）。50、100、200 μmol/L POA 處理細胞24 h 后，細胞活力分別提高了3.7%、6.3%和2.8%。但是，當POA 濃度達400、500 μmol/L時，細胞活力分別下降了13.4%和17.7%（P＜0.05）（圖1b）。這些結果表明，POA濃度在200 μmol/L以下時，對BV-2 細胞活力沒有顯著影響。

圖1 PA 和POA 處理小膠質(zhì)細胞后活力與PI陽性細胞數(shù)量統(tǒng)計

200 μmol/L PA 和POA 處理小膠質(zhì)細胞4 h 后，對細胞進行PI 染色。BSA、PA 和POA 組細胞PI 陽性細胞占比分別為0.8%±0.3%、13.0%±0.9% 和0.9%±0.3%（圖1c）。該結果表明，PA 處理小膠質(zhì)細胞后會導致焦亡，而POA 處理BV-2 細胞4 h 并不會引起細胞焦亡。由于凋亡通常發(fā)生較慢，因此用200 μmol/L PA 和POA 處理小膠質(zhì)細胞24 h 后，對細胞進行TUNEL 染色。PA 組TUNEL 陽性細胞數(shù)量顯著高于對照組（BSA）和POA 組（P＜0.05），而POA處理后未見有TUNEL 陽性細胞增多（圖2）。

圖2 PA 和POA 處理小膠質(zhì)細胞后PI與TUNEL 染色

2.2 尿素硅膠柱色譜法分離純化可獲得高純度棕櫚油酸乙酯

在前期篩選并優(yōu)化了負載尿素結晶硅膠柱色譜條件后，以柱長40 cm，流速1 mL/min，石油醚∶乙酸乙酯（V/V）300∶1，尿素硅膠質(zhì)量比2∶3，硅膠目數(shù)200 目為最終柱色譜條件。洗脫收集組分經(jīng)氣相色譜檢測后主要組分含量如表1 所示，最終以峰面積為定量依據(jù)，得到棕櫚油酸乙酯含量為72.3%，收率為35.0%。相較于魚油膠囊（棕櫚油酸乙酯含量50.5%，棕櫚酸乙酯含量9.3%），經(jīng)尿素結晶硅膠柱分離純化后，棕櫚油酸乙酯純度提高了21.8 個百分點，而棕櫚酸乙酯含量下降了3.7 個百分點（圖3，表1）。經(jīng)氣相色譜分析后的產(chǎn)物用于進一步飼喂動物。

表1 魚油膠囊經(jīng)尿素硅膠柱純化后棕櫚酸乙酯和棕櫚油酸乙酯含量對比（單位：%）

圖3 純化后棕櫚油酸乙酯的脂肪酸組分氣相色譜分布

2.3 POA 對小鼠下丘腦神經(jīng)膠質(zhì)細胞無明顯影響，而PA 同時激活小膠質(zhì)細胞和星形膠質(zhì)細胞

小鼠經(jīng)PA 和純化后POA 灌胃2 周后，取腦組織進行石蠟包埋、切片，免疫組織化學染色分析Iba-1、GFAP、Ki67（圖4）。PA 組下丘腦Iba-1 陽性小膠質(zhì)細胞數(shù)量比對照組多45.6%（P＜0.05），且形態(tài)多為有觸角的激活態(tài)小膠質(zhì)細胞。而POA 處理組則未見顯著的小膠質(zhì)細胞增多與形態(tài)學上的變化（圖4，圖5a）。PA 組下丘腦GFAP 陽性星形膠質(zhì)細胞比對照組多75.0%（P＜0.05），形態(tài)上多為胞體肥大的反應性星形膠質(zhì)細胞。POA 處理組則未見顯著的星形膠質(zhì)細胞增多與形態(tài)學上的變化（圖4，圖5b）。但是，PA 喂食組以及POA 喂食組中下丘腦細胞增殖標記物Ki67 相較于對照組未見顯著增多（圖4，圖5c）。

圖4 小鼠下丘腦免疫組織化學染色

圖5 小鼠下丘腦免疫組織化學染色陽性細胞占比統(tǒng)計

2.4 棕櫚酸和棕櫚油酸均可以刺激小鼠下丘腦髓鞘合成

髓鞘堿性蛋白（MBP）是一種含有多種堿性氨基酸能維持CNS 髓鞘結構和功能穩(wěn)定的強堿性膜蛋白質(zhì)。圖6 顯示，相較于對照組，PA 和POA 喂食2 周均能增加下丘腦MBP的表達。MBP陽性區(qū)域占比統(tǒng)計如圖7 所示，PA 喂食組比對照組小鼠下丘腦MBP陽性區(qū)域占比增加了36.6%（P＜0.001），POA喂食組比對照組MBP陽性區(qū)域占比增加了18.1%（P＜0.01）。

圖6 小鼠下丘腦MBP 免疫組織化學染色

圖7 小鼠下丘腦MBP 免疫組織化學染色陽性細胞占比統(tǒng)計

3 討論

本研究通過PI和TUNEL 染色發(fā)現(xiàn)PA 導致的死亡主要是焦亡和凋亡，而POA 不引起焦亡或凋亡。同時探索了一種經(jīng)濟地制備高純度POA 的方法。飲食中的PA 能夠激活小鼠下丘腦小膠質(zhì)細胞和星形膠質(zhì)細胞，POA 則不激活小膠質(zhì)細胞和星形膠質(zhì)細胞。PA 和POA 能夠促進小鼠下丘腦MBP 表達，這表明PA 和POA 都能增強少突膠質(zhì)細胞的髓鞘化作用。

少突膠質(zhì)細胞的主要功能是形成髓鞘包裹神經(jīng)元，增加神經(jīng)傳導效率。髓鞘是非常穩(wěn)定的結構，有報道顯示，超過5 000 年的冰凍樣本髓鞘還非常完整［15］，這得益于髓鞘的特殊脂肪酸組成結構，髓鞘的飽和脂肪酸含量高，不飽和脂肪酸僅約占4%，而灰質(zhì)中的不飽和脂肪酸則約占20%［16］。推測外周環(huán)境中的飽和脂肪酸能夠直接刺激MBP 的合成，而POA 能夠在硬脂酰輔酶A 去飽和酶1 的作用下部分轉(zhuǎn)化為PA，從而促進MBP 合成。通過免疫組化分析觀察到PA 能夠同時促進小膠質(zhì)細胞和星形膠質(zhì)細胞的激活和增殖，但是增殖蛋白標記的Ki67 陽性細胞數(shù)量卻未見顯著增多，這可能是因為Ki67 是分析動物組織被固定瞬間的增殖細胞數(shù)量，后續(xù)試驗考慮在飲水中添加BrdU 或腹腔注射BrdU的方法來分析長時間的細胞增殖情況［17］。

檢測細胞死亡的常用染料PI 通常被用于檢測細胞凋亡，但是PI 實際上首先檢測的是能夠在細胞膜上打孔的細胞壞死方式，因此PI 被認為能夠快速準確判斷細胞是否發(fā)生了焦亡［18，19］。焦亡是非常急性的一種壞死方式，通常外界刺激發(fā)生2 h 后就引起明顯焦亡，而凋亡作為一種無菌性的死亡方式通常先發(fā)生染色質(zhì)皺縮，細胞膜外翻［20］。

采用制備液相色譜因為填料成本高，產(chǎn)品附加值相對較低，難以產(chǎn)業(yè)化。本研究采用的尿素柱色譜作為一種簡單、經(jīng)濟的方法可被推廣用于制備高純度的POA。本研究中使用了石油醚作為洗脫溶劑，后續(xù)工業(yè)放大過程中可考慮選用食品加工助劑己烷替代石油醚，己烷作為食用油的浸出溶劑已獲廣泛應用。后續(xù)研究將嘗試通過將POA 和PA 同時喂食的方式來確定POA 是否能夠保護PA 對下丘腦膠質(zhì)細胞的激活作用，并分析其作用機制。