平眩方對椎動脈型頸椎病模型SD 大鼠的治療作用及機制研究

王怡璇 彭 楠 肖晶晶 李騰龍▲ 李 璐

1.湖南中醫藥大學第二附屬醫院骨傷一科，湖南長沙 410005；2.成都市雙流區第一人民醫院中醫骨傷科，四川成都 610200

椎動脈型頸椎病（cervical spondylotic arteriopathy，CSA）是頸椎病常見分型之一，是指眩暈與頸部疼痛癥狀相關聯的一種臨床綜合征[1-3]。CSA 患者被頸部疼痛及陣發性眩暈困擾，極大地影響了患者的生活質量[4-5]。近年來，CSA 的發病率逐年攀升、發病人群逐漸年輕化[6]，找到治療CSA 的有效方法成為亟待解決的臨床問題。中醫對于頸椎病的治療獨具特色，CSA 在中醫隸屬于“眩暈”范疇。平眩方是治療CSA 的經驗方，經過臨床反復使用和驗證，療效安全、穩定，患者反饋良好[7-10]。為了進一步探索平眩方治療CSA 的作用機制，本研究探討平眩方對于CSA 模型大鼠椎動脈血流情況、血液流變學、血漿內皮素（endothelin，ET）及血清一氧化氮（nitric oxide，NO）水平、椎動脈血管壁中膜厚度的影響。

1 對象與方法

1.1 實驗動物

SPF 級SD 大鼠60 只（雌雄各半），8 周齡，體重（200±20）g，由湖南中醫藥大學實驗動物中心提供。在室溫（25±1）℃、濕度45%～50%的條件下飼養。動物許可證號：SYXK（湘）2019-0009，動物生產合格證號：430727221100472812。實驗已獲得湖南中醫藥大學動物倫理委員會批準（LL2022022304）。

1.2 實驗藥物

消痔靈注射液（國藥準字：Z22026175，吉林省集安益盛藥業股份有限公司），氟桂利嗪膠囊（國藥準字：KKJ0QH5，西安楊森制藥有限公司）。平眩方的制備：半夏、天麻、黃芪、當歸、鉤藤、白術、茯苓、川芎、赤芍、桃仁、紅花、地龍、甘草的質量比為1∶3∶6∶2∶2∶2∶2∶2∶2∶1∶1∶1∶1（湖南中醫藥大學第二附屬醫院中藥房提供），加入藥物總質量的10 倍量蒸餾水提取2 h，過濾保留濾液，濾渣加入藥物開始總質量的8 倍量蒸餾水操作同前，將兩次濾液合并，旋轉蒸發濃縮至2 g/ml，-20℃保存備用。

1.3 主要試劑與儀器

NO 硝酸還原酶法試劑盒（貨號：FY40104-A，江蘇菲亞生物科技有限公司）；ET 放射免疫法試劑盒（貨號：FY3509-A，江蘇菲亞生物科技有限公司）；蘇木精-水溶性伊紅染色液（貨號：BA4025，武漢貝索生物技術有限公司）；中性樹膠（貨號：10004160，中國醫藥集團有限公司）。彩色多普勒超聲診斷儀（型號：D350-VET，飛依諾科技股份有限公司）；全自動血流變測試儀（型號：ZL9100，北京眾馳自動化設備有限公司）；脫水機（Donatello，湖南迪佩斯智能科技有限公司）；包埋機（型號：JB-P5，武漢俊杰實業集團有限公司）；病理切片機（型號：RM2016，上海徠卡儀器有限公司）；組織攤片機（型號：KD-P，浙江科迪集團有限公司）；顯微鏡（型號：E100，尼康）。

1.4 實驗分組及處理

60 只大鼠適應性喂養1 周，按照隨機數字表法分為6 組：正常組，模型組，氟桂利嗪組，平眩方低、中、高劑量組，每組各10 只。除正常組外，其他組均進行造模處理。

采用改良注射硬化劑法[11-13]制作CSA 大鼠模型：腹腔注射3%戊巴比妥鈉麻醉，將大鼠放置呈右側臥位，從左側肱骨頭上緣垂直頸椎進針注射5 ml/kg 消痔靈注射液于大鼠左側第3～5 頸椎橫突孔周圍肌肉，1 周后重復注射。

造模4 周后大鼠灌胃給藥，根據人與大鼠體表面積折算法[14]計算各組給藥劑量。氟桂利嗪組給予0.9 mg/kg 氟桂利嗪膠囊（相當于成人劑量10 mg/d，用0.9%NaCl 配成0.1 mg/ml），平眩方中劑量組給予15.6 g/kg 平眩方濃縮液（臨床有效劑量，相當于成人劑量130 g/d），平眩方低、高劑量組分別予7.80、31.2 g/kg平眩方濃縮液，正常組及模型組不予治療。連續給藥2 周，1 次/d。

1.5 觀察指標及檢測方法

1.5.1 大鼠椎動脈經顱多普勒超聲（transcranial doppler，TCD）檢測 末次給藥后，所有大鼠禁食禁水12 h，腹腔注射3%戊巴比妥鈉麻醉，枕后及頸部備皮，TCD 測定左側椎動脈平均血流速度（mean velocity，Vm）、搏動指數（pulsation index，PI）、阻力指數（resistance index，RI）。

1.5.2 大鼠血液流變學及血漿NO、血清ET 表達的檢測末次給藥后，所有大鼠禁食禁水12 h，腹腔注射3%戊巴比妥鈉麻醉，下腔靜脈取血5 ml，置肝素管進行全血黏度[低（1/s）、中（5/s、30/s）、高（200/s）切變率下檢測]、全血低/高切相對指數和紅細胞聚集指數測定；全血經25℃、3 000 r/min離心10 min，取血漿測定血漿黏度，所有樣本在4 h 內檢測完畢。另取1 ml全血于普通管靜置30 min 后，樣品離心取上層血清（4℃，離心半徑8 cm，3 000 r/min，10 min），按試劑盒說明書檢測血清中NO 水平；另取1 ml 全血于肝素管中混勻30 min 后，樣品離心分離上層血漿（4℃，離心半徑8 cm，3 000 r/min，30 min），按試劑盒說明書檢測血漿中ET 水平。

1.5.3 大鼠椎動脈血管壁中膜厚度的檢測 取大鼠左側椎動脈3～5 mm 組織，4%多聚甲醛固定48 h，石蠟包埋，切片，蘇木精-伊紅染色，顯微鏡下觀測血管壁中膜厚度。

1.6 統計學方法

采用SPSS 27.0 統計學軟件進行數據分析，計量資料采用均數±標準差（）表示，多組間比較均采用單因素方差分析，進一步兩兩比較采用LSD-t 檢驗。以P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組大鼠左側椎動脈血流TCD 檢測

與正常組比較，模型組左側椎動脈Vm 降低，PI與RI 升高（P＜0.05）；與模型組比較，平眩方中、高劑量組左側椎動脈Vm 升高，PI 與RI 降低（P＜0.05）；與平眩方低劑量組比較，平眩方中、高劑量組的左側椎動脈Vm 升高，PI 與RI 降低（P＜0.05）。見圖1。

2.2 各組血液流變學指標比較

與正常組比較，模型組低、中、高各切變率下的全血黏度，血漿黏度、全血高/低切相對指數、紅細胞聚集指數均升高（P＜0.05）；與模型組比較，平眩方中、高劑量組血液流變學各指標均降低（P＜0.05）；與平眩方低劑量組比較，平眩方中、高劑量組血液流變學各指標均降低（P＜0.05）。見圖2～3。

圖2 各組大鼠全血黏度比較（n=10）

圖3 各組大鼠血漿黏度、全血高/低切指數、紅細胞聚集指數比較（n=10）

2.3 各組血漿ET、血清NO 含量比較

與正常組比較，模型組血漿ET 水平升高，血清NO水平降低（P＜0.05）；與模型組比較，平眩方中、高劑量組血漿ET 水平降低，血清NO 水平升高（P＜0.05）；與平眩方低劑量組比較，平眩方中、高劑量組血漿ET水平降低，血清NO 水平升高（P＜0.05）。見圖4。

圖4 各組大鼠NO、ET 檢測結果（n=10）

2.4 各組血管壁中膜厚度比較

與正常組比較，模型組椎動脈血管壁中膜平滑肌細胞肥大增生明顯，血管壁中膜厚度增加，差異有統計學意義（P＜0.05）；與模型組比較，平眩方中、高劑量組血管壁中膜平滑肌細胞肥大增生明顯受到抑制，血管壁中膜厚度降低（P＜0.05）；與平眩方低劑量組比較，平眩方中、高劑量組血管壁中膜厚度降低（P＜0.05）。見圖5、表1。

圖5 各組大鼠椎動脈切片（HE 染色，200×）

表5 各組大鼠椎動脈血管壁中膜厚度比較（μm，）

表5 各組大鼠椎動脈血管壁中膜厚度比較（μm，）

注 與正常組比較，aP＜0.05；與模型組比較，bP＜0.05；與平眩方低劑量組比較，cP＜0.05。

3 討論

CSA 是骨科的常見病，因頸椎內外結構的平衡被破壞，導致椎動脈受壓引起眩暈、目眩及視物模糊等一系列臨床表現，影響患者的生活工作，造成嚴重的經濟負擔和心理壓力[2-5]。隨著CSA 的深入研究，改善血液流變學指標、緩解椎動脈血管痙攣是目前治療的主要思路、中醫藥治療從整體觀念、辨證論治的角度出發，為CSA 的治療帶來了新的可能、平眩方臨床效果顯著，全方具有化痰熄風、活血通絡之功，使痰散瘀消、血脈通行、眩止痛緩。本研究使用平眩方干預治療CSA 大鼠模型探討平眩方治療CSA 可能存在的作用機制。

腦供血不足是CSA 常見的病理變化，其根本原因在于椎動脈受壓，使血流速度減慢，頸椎局部炎癥刺激椎動脈痙攣，進而導致椎-基底動脈供血不足，腦部因缺氧而眩暈[15-16]。通過TCD 檢測椎動脈的血流變化，可以評估腦供血不足的程度及恢復情況。研究證實，CSA 發病與血液流變學波動呈正相關[17-18]。發病期間CSA 患者的血液流變學各指標明顯升高，細胞聚集性增高，血液處于高黏狀態，血流速度減慢，導致腦部供血減少[19]。ET 是由血管內皮細胞分泌的生物活性多肽，能收縮血管[20-21]，NO 能抑制ET 的縮血管作用，可使內皮下血管平滑肌細胞處于增殖靜止狀態而達到抗血管壁增殖的作用[22-23]。長期由炎癥引起的氧化應激反應可能會引起椎動脈血管平滑肌細胞肥大、增殖，進而引發血管重構[24]。血管壁中膜厚度是確定血管重構的重要指標之一[24-25]。本研究將TCD 檢測血流變化、血液流變學指標、血清NO、血漿ET 和血管壁中膜厚度作為觀察指標。

本研究結果顯示，平眩方中、高劑量干預CSA 大鼠模型后，能夠升高椎動脈Vm，降低Pi 與RI，提示平眩方能夠改善椎動脈的血流情況；平眩方中、高劑量組各切變率下的血漿黏度，全血高、低切指數及紅細胞聚集指數顯著降低，提示平眩方在改善血液流變學、稀釋血液黏度、維持紅細胞形變穩定方面具有積極作用；平眩方中、高劑量組能夠降低ET 水平、增加NO 水平、抑制椎動脈血管壁中膜增厚，提示平眩方能夠通過調節ET 與NO 的平衡關系，從而改善椎動脈痙攣、減少局部炎癥的產生，進一步抑制平滑肌細胞增殖，抑制血管損傷及重構、紅細胞變形性受許多因素影響。目前有關紅細胞變形性及血管重構與CSA 的相關研究較少，未來可以進一步研究。

綜上所述，CSA 的發病機制可能與血管收縮舒張功能失調、血流動力和血液流變學指標異常、椎動脈增殖重構等相關。