微RNA-142-5p 與E2F7 基因的關系及其影響胰腺癌增殖、侵襲、轉移的機制研究

阿木提江·馬合木提 鄭堅江 迪里夏提·阿力木

新疆維吾爾自治區人民醫院胰腺外科，新疆烏魯木齊 830001

胰腺癌（pancreatic cancer，PC）相關死亡率居中國癌癥相關死亡率的第六位[1]，盡管手術、化療和放療等方法取得了巨大進步，但其5 年生存率仍較差[2-3]。微RNA（microRNA，miRNA）是短鏈非編碼RNA 分子，其通過與靶基因結合的方式調節基因表達[4-5]。最近，許多研究發現miRNA 在腫瘤中表達異常[6-8]，其中miR-142-5p 在疾病中存在表達失調[9-13]。E2F 轉錄因子家族在細胞周期和腫瘤進程中起作用[14-15]，研究發現E2F7在許多類型的腫瘤中上調[16]，但其在不同癌癥中所起的作用存在爭議。因此，本研究探討miR-142-5p與E2F7 基因的關系及其影響PC 增殖、侵襲、轉移的機制，為PC 的生物標志物篩選提供依據。

1 材料與方法

1.1 臨床樣本

選擇2016 年12 月至2019 年1 月于新疆維吾爾自治區人民醫院（以下簡稱“我院”）接受手術治療的35 例PC 患者，患者術前未接受任何化療、放療或免疫治療，其癌及癌旁組織切除后在液氮中保存。患者均簽署廣泛性知情同意書，本研究經過我院醫學倫理委員會審批[2016 年（12）01 號]。

1.2 細胞培養

人PC 細胞系（CFPAC-1、SW1990、Capan-1、PANC-1）和正常胰管上皮細胞系（HPDE）購自北納生物有限公司。細胞放置在5%CO2和37℃的培養箱中，在含有10%胎牛血清（美國Gibco，10099）的RPMI-1640 培養基（美國Gibco，A1049101）中培養。

1.3 細胞轉染

1.4 實時熒光定量PCR 檢測mRNA 相對表達量

使用SYBR Green PCR 試劑盒（日本TaKaRa，RR 407A）分析miR-142-5p 及E2F7 mRNA 的表達。U6和GAPDH 分別為miR-142-5p 和E2F7 mRNA 的內參基因。miR-142-5p 引物正向序列為5’-CAUAAAGUAGAAAGCACUACU-3’，反向序列為5’-UAGUGCUUUCUACUUUAUGUU-3’；U6 引物正向序列為5’-CTCGCTTCGGCAGAC-3’，反向序列為5’-AACGCTTACGAATTT-3’；E2F7 mRNA 引物正向序列為5’-CAAGCTAGTAGTCCTTGGTTCAG-3’，反向序列為 5’-GGAATCTTCTATCGTTGGGTCAT-3’；GAPDH引物正向序列為5’-AACAGCAACTCCCACTC -TTC-3’，反向序列為5’-CCTGTTGCTGTAGCCGTATT-3’。循環條件：95℃變性10 min，隨后95℃10 s、55℃10 s 和72℃30 s 40 個循環。PCR 反應體系為SYBR染色劑（2×）10 μl，正向引物（10 μmol/L）0.5 μl，反向引物（10 μmol/L）0.5 μl，cDNA 1.0 μl；ddH2O 9.0 μl。采用2-△△Ct法對基因表達進行相對定量。

1.5 蛋白質印跡法檢測蛋白的相對表達量

蛋白質電泳轉印后用5%脫脂牛奶的磷酸鹽緩沖液封閉后用anti-E2F7（廣州西格生物科技有限公司，XG-K9691），anti-GAPDH（美國Abcam，ab8245），濃度為1 μg/ml，孵育過夜后加入辣根過氧化物酶結合的二抗（Santa Cruz Company）（1∶5 000）。通過化學發光試劑盒（美國Millipore Company，mc175968）檢測條帶灰度值。

1.6 雙螢光素酶報告基因檢測

采用Starbase 數據庫（https://starbase.sysu.edu.cn/）對miR-142-5p 和E2FE 基因的靶向位點和結合序列進行預測。合成miR-142-5p 預測靶位點內的E2F7 基因野生型（wild type，wt）或突變體（mutant，mut），并克隆到pGL3 控制載體（美國Promega Madison，WI）。將1×105個細胞接種到24 孔板中，待融合度達到80%后再轉染。通過Lipofectamine2000 試劑（美國Life Technologies）將E2F7 的wt 或mut 的3’非翻譯區（untranslated region，UTR）共轉染到miR-142-5p minmics 組、NC 組中，通過雙螢光素酶（美國Promega，E1960）報告系統評估螢光素酶活性。

1.7 細胞增殖實驗

通過CCK-8 試劑盒（碧云天生物技術有限公司，C0037）來確定細胞活力，按照制造商的操作說明檢測各細胞增殖情況。

1.8 細胞凋亡檢測

收集各組細胞后用5 μl 膜聯蛋白V 和5 μl 碘化丙啶稀釋的100 μl 緩沖液，應用凋亡檢測試劑盒（南京建成科技有限公司，G003-1-2）染色20 min 后，通過流式細胞儀（美國FACScan，FA-4570）檢測凋亡率。

1.9 Transwell 侵襲實驗

Transwell 上室涂有基質膠。將2×105個細胞與不含血清的培養基一起加入上室，下室含有DMEM 和20%胎牛血清（美國Gibco，10099）。然后將細胞在37℃、5%CO2條件下培養48 h。隨后，使用棉簽去除上室中的細胞，下室固定并用DAPI 染色5 min。基于顯微鏡捕獲的數字圖像，使用Image J 軟件計算侵入膜的細胞數量。

1.10 劃痕實驗

將各處理組細胞接種到6 孔培養皿中，在適當條件下培養48 h。用消毒的移液管尖端在細胞單層上產生傷口，然后用磷酸鹽緩沖液洗滌細胞并在含有10%FBS 的DMEM 中孵育48 h。在倒置顯微鏡下分別在0、24 h 觀察劃痕愈合情況，并通過從相應的原始劃痕寬度中減去愈合后劃痕寬度來測量。

1.11 裸鼠成瘤實驗

20 只雄性BALB/c 裸鼠（4～6 周齡）購自北京維通利華實驗動物有限公司，用于建立裸鼠異種移植模型采用隨機數字表法將其分為NC 裸鼠組、si-E2F7裸鼠組、E2F7 裸鼠組及miR-142-5p mimics+E2F7 裸鼠組，每組5 只。在整個實驗過程中，所有裸鼠都被置于無病原體的環境中，將5×106個不同處理組細胞與100 μl 的人工基膜混合后皮下注射于裸鼠前腿下方的皮膚。所有裸鼠于注射后第30 天處死，腫瘤體積每5 天用卡尺測量，腫瘤體積=長（mm）×寬（mm）×寬（mm）/2。

1.12 統計學方法

采用SPSS 22.0 統計學軟件進行數據分析。計量資料采用均數±標準差（）表示，比較采用t 檢驗。以P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 miR-142-5p 在PC 中的表達

PC 患者癌組織中miR-142-5p 表達低于癌旁組織，CFPAC-1、SW1990、Capan-1、PANC-1 細胞中miR-142-5p 表達低于HPDE 細胞（P＜0.05）。見圖1。

圖1 miR-142-5p 在PC 中的表達

2.2 E2F7 基因在PC 中的表達及與miR-142-5p的關系

PC 患者癌組織中E2F7 mRNA 表達高于癌旁組織，Capan-1、PANC-1 細胞中E2F7 mRNA 及其蛋白表達高于HPDE 細胞（P＜0.05）。Starbase 數據庫分析結果顯示，miR-142-5p 與E2F7 基因的3’UTR 存在互補。雙螢光素酶報告基因結果顯示，共轉染E2F7-wt后，miR-142-5p mimics 組螢光素酶活性低于NC 組（P＜0.05）；共轉染E2F7-mut 后，miR-142-5p mimics組螢光素酶活性與NC 組比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。見圖2。

圖2 E2F7 基因在PC 中的表達及與miR-142-5p 的關系

2.3 miR-142-5p 調控E2F7 基因對Capan-1 細胞功能的影響

E2F7 組E2F7 mRNA 及其蛋白表達、細胞活力、劃痕愈合面積、相對侵襲細胞數高于NC 組，細胞凋亡率低于NC 組（P＜0.05）。miR-142-5p mimics+E2F7 組mRNA 及其蛋白表達、細胞活力、劃痕愈合面積、相對侵襲細胞數低于E2F7 組，細胞凋亡率高于E2F7 組（P＜0.05）。見圖3。

2.4 miR-142-5p 調控E2F7 基因對腫瘤生長的影響

E2F7 裸鼠組腫瘤體積、重量高于NC 裸鼠組，miR-142-5p mimics+E2F7 裸鼠組腫瘤體積、重量低于E2F7 裸鼠組（P＜0.05）。蘇木精-伊紅染色顯示，E2F7 裸鼠組腫瘤具有較強的轉移能力，而miR-142-5p mimics+E2F7 裸鼠組腫瘤的轉移能力較差。見圖4。

圖4 miR-142-5p 調控E2F7 基因對腫瘤生長的影響（n=5）

3 討論

miRNA 調節癌癥進展中的細胞增殖、凋亡、分化、侵襲和遷移，其通過調控不同靶基因發揮作用[17-18]。另有數據顯示，miR-142-5p 過表達會抑制PC 生長[19]。本研究發現，miR-142-5p 在PC 中低表達，miR-142-5p能夠抑制E2F7 基因過表達的PC 細胞增殖且促進細胞凋亡，可能原因為miRNA 通過降解mRNA 或抑制其翻譯來調節基因表達[20-25]。本研究結果顯示，E2F7基因是miR-142-5p 的靶基因之一，并且在PC 中高表達。轉染miR-142-5p 模擬物的細胞活力受到抑制，而E2F7 基因過表達PC 細胞的活力增強。本研究結果顯示，E2F7 組細胞凋亡率低于NC 組，miR-142-5p mimics+E2F7 組細胞凋亡率高于E2F7組，同時E2F7 組細胞具有更強的遷移和侵襲能力，而miR-142-5p mimics+E2F7 組細胞的遷移和侵襲能力受到抑制。

綜上，本研究結果提示miR-142-5p 通過調控E2F7 基因表達抑制PC 細胞的增殖、遷移和侵襲，可為預測PC 的預后和治療靶點提供新的生物標志物。