胰腺癌患者外周血循環腫瘤細胞ARK5表達與吉西他濱化療療效及預后的相關性

高趙峰 郭偉 楊曉丹 劉梟榮 胡凌煜 王曉光

嘉興學院附屬第二醫院肝膽外科,嘉興 314000

胰腺癌是一種侵襲力極強、惡性程度極高的消化系統腫瘤,至2030年或成為第二大癌癥相關死亡的原因[1]。由于早期診斷率低、手術可切除率低,化療在胰腺癌患者的綜合治療中扮演著不可或缺的角色。在眾多胰腺癌化療方案中,吉西他濱一直是胰腺癌臨床化療的一線用藥,但由于固有耐藥和獲得性耐藥的存在,制約著吉西他濱的藥效發揮[2]。目前尚缺乏生物標志物或其他無創性監測手段來實現胰腺癌的精準化療指導。ARK5(AMPK-related kinase5)是AMPK(AMP-activated protein kinase)的亞家族成員之一[3]。研究表明ARK5表達水平與腫瘤惡性程度呈正相關[4-6]。筆者團隊前期研究結果[7]也證實胰腺癌組織ARK5呈高表達,且其表達水平與腫瘤對吉西他濱敏感性呈負相關,提示ARK5可能是胰腺癌化療耐藥的潛在預測指標。本研究通過無創性檢測胰腺癌患者外周血循環腫瘤細胞(circulating tumor cells,CTCs)的ARK5的表達,隨訪比較ARK5表達陽性與陰性胰腺癌患者的吉西他濱化療療效及預后,探討檢測CTCs ARK5表達用于指導胰腺癌吉西他濱化療的臨床價值。

資料與方法

一、臨床資料

收集2016年1月至2021年6月間嘉興學院附屬第二醫院收治的175例胰腺癌患者外周血標本,并運用高效納米微流控芯片技術富集CTCs。納入標準:(1)所有患者均經超聲內鏡下細針穿刺取得活檢組織,并經兩位高年資病理科醫師讀片確診胰腺癌;(2)均采用臨床一線化療方案(吉西他濱方案)治療,既往均未接受過手術、免疫治療、全身放化療或其他特殊治療方式;(3)均運用免疫熒光法檢測CTCs ARK5的表達;(4)患者血常規、肝腎功能、心肺功能基本正常,心理健康良好。記錄患者的年齡、性別、臨床癥狀、腫瘤大小、腫瘤部位、TNM分期、血CA19-9及CEA水平以及轉移灶情況等指標。本研究通過嘉興市第二醫院倫理委員會審批(jxey-20180012),所有患者或家屬均簽署知情同意書。

二、CTCs富集及其ARK5表達檢測

1．納米微流控芯片富集CTCs:采集患者4 ml新鮮外周血樣本,移至抗凝離心管內。每支離心管加入紅細胞裂解液(不含固定劑)14 ml,輕搖離心管,使細胞沉淀混勻,置于4℃ 15 min,再以1 000 r/min離心5 min(離心半徑20 cm),棄上清。加入10 ml以PBS 500 ml+EDTA 0.375 g+BSA 2.5 g配置的緩沖液,懸勻沉淀的細胞,再加入5 μl能與CTCs結合的EpCAM抗體偶聯的納米捕獲磁珠(浙江華宇生物科技有限公司)混均,然后將樣本液緩慢移至納米微流控分離系統(無錫納奧生物醫藥有限公司),以2.0 ml/min的進樣速度[8]通過Nextctc納米微流控芯片,棄去外管內富集的白細胞,獲取并收集內管和中管內CTCs富集液。

2．CTCs表面標志物DAPI、CK及ARK5表達檢測:取每個樣本的富集液3～4 ml,以1 000 r/min離心5 min(離心半徑15 cm),制備CTCs載玻片。以新鮮配置的2%多聚甲醛固定10 min,再用2.5% Triton X-100的PBS透化處理細胞10 min,2% BSA封閉30 min。然后分別加熒光標記的CK-FITC抗體,避光孵育30 min;加熒光標記的DAPI抗體,避光孵育10 min;加熒光標記的ARK5-Alexa Fluor647抗體,避光孵育20 min,最后用20 μl封片劑封片,以不加抗體的CTCs作為對照。載玻片干燥后置熒光顯微鏡下觀察。熒光標記抗體均購自美國Invitrogen公司。CTCs的熒光特征為:DAPI陽性表達呈藍色熒光,CK陽性表達呈綠色熒光,ARK5陽性表達呈紅色熒光。依據ARK表達情況分為陽性組和陰性組。

三、化療方案與臨床評價

吉西他濱化療方案4周為1個療程,每療程第1、8、15天靜脈滴注吉西他濱1 000 mg/m2,每4周重復[9]。治療持續至患者出現病情進展或者出現不可耐受的不良反應時終止。療效判斷依據為WHO實體瘤療效評價標準[10],分為完全緩解(complete response,CR)、部分緩解(partial response, PR)、疾病穩定(stable disease, SD)、疾病進展(progressive disease, PD),其中有效患者數量為CR+PR+SD例數,耐藥患者數量為PD例數。出院后通過門診或電話進行隨訪,記錄患者的生存狀況和死亡時間。總生存期(overall survival,OS)是指疾病確診之日至末次隨訪或死亡日期,無進展生存期(progression-free survival,PFS)指患者確診之日至第一次發生腫瘤進展或死亡時間[11]。

四、統計學處理

結 果

一、患者的臨床資料

175例胰腺癌血標本運用高效納米微流控芯片技術成功富集到CTCs標本98例,富集成功率為55.6%。98例患者中男性57例,女性41例,年齡55～76歲,平均66歲;有臨床癥狀51例;腫瘤長徑2～6 cm;腫瘤位于胰頭部73例,體尾部25例;TNM分期Ⅲ期43例,Ⅳ期55例;血清CA19-9水平7～2 366 U/L,CEA水平3～124 U/L;腫瘤有肝臟轉移53例。98例CTCs標本經免疫熒光檢測后,ARK5陽性表達70例,ARK5陽性表達率為71.4%,陰性表達28例(圖1)。ARK陽性組和陰性組患者的臨床資料比較見表1,兩組的臨床基線差異均無統計學意義,具有可比性。

圖1 循環腫瘤細胞明視野(1A)及DAPI陽性(1B)、CK陽性(1C)、ARK5陽性(1D)表達(免疫熒光法)

二、CTCs ARK5陽性表達與吉西他濱化療療效的相關性

70例CTCs ARK5陽性組患者中64例(91.4%)對吉西他濱化療產生了耐藥性,28例ARK5陰性組患者中12例(42.8%)對吉西他濱化療產生了耐藥性,ARK5陽性組患者吉西他濱耐藥發生率顯著高于ARK5陰性組,差異有統計學意義(χ2=27.102,P<0.001),提示ARK5陽性表達與胰腺癌吉西他濱化療療效呈負相關。

三、ARK5表達與患者平均生存期的關系

98例患者均接受吉西他濱2～12個療程化療,平均3.84個療程。化療后行2～20個月的跟蹤隨訪,平均隨訪時間為15個月,無失訪。隨訪結果顯示,ARK5陽性組患者的中位生存期為11.5個月,ARK5陰性組為14個月(圖2A);ARK5陽性組患者無進展生存期為6個月,陰性組為8個月(圖2B),ARK5陽性組患者中位生存期和無進展生存期均顯著低于陰性組,差異有統計學意義(P值分別為0.440、0.043)。

圖2 循環腫瘤細胞ARK陽性和陰性胰腺癌患者的總生存期(2A)和無進展生存期(2B)曲線

討 論

ARK5又稱為NUAK1,位于Akt下游,可由Akt進行信號調控,在復雜的腫瘤網絡中起著關鍵作用[11]。ARK5具有介導人類胰腺癌細胞遷移的能力,對胰腺癌的進展具有顯著影響[12]。在本課題組前期研究中,發現下調ARK5可提高胰腺癌細胞對化療藥物吉西他濱的敏感性,同時通過調控EMT通路,抑制腫瘤進展[7]。因此筆者推測ARK5有希望成為一種潛在的胰腺癌化療預后的精準檢測手段,有助于指導臨床及時改進方案及劑量,實現精準化個性化治療。

既往的研究中,檢測ARK5通常需要獲取胰腺癌組織,但由于胰腺癌發病隱匿,確診時僅有10%～20%的患者有手術機會[13],因此通過在切除樣本組織中檢測ARK5的應用范圍較為局限。CTCs是一種細胞成分,可以儲存在原發性、轉移性、甚至是播散性腫瘤中,脫落后通過血流擴散,引起腫瘤的轉移和復發。近年研究顯示,外周血CTCs的遺傳學特征與原發灶的腫瘤細胞極為相似[14],這為筆者在開發檢測CTCs ARK5表達新方法方面提供了新思路。本研究采用納米微流控芯片技術在175例中晚期胰腺癌患者檢測和富集到98例的CTCs,富集成功率高達55.6%,遠高于目前常應用的技術[15],為檢測CTCs ARK5表達打下基礎。研究結果顯示,胰腺癌CTCs ARK5表達陽性患者的吉西他濱化療耐藥發生率明顯高于ARK5表達陰性患者,中位生存期和無進展生存期均顯著低于ARK5陰性患者,差異均有統計學意義,提示對CTCs ARK5表達陽性患者單獨應用吉西他濱化療的療效有限,這一結果有助于指導臨床醫師對胰腺癌化療藥物的選擇及對中晚期胰腺癌患者的精準治療。未來有待納入更多患者并通過多中心研究進一步驗證。

利益沖突所有作者聲明無利益沖突

作者貢獻聲明高趙峰:研究操作、論文撰寫、數據整理、統計學分析;郭偉:研究操作、數據整理、統計學分析,論文修改;楊曉丹、劉梟榮:病例數據收集、臨床診療、工作支持;胡凌煜:研究操作、數據整理、統計學分析、論文修改;王曉光:研究設計、研究指導、論文修改、經費支持