基于HPLC-Q-TOF-MS技術分析益氣生津袋泡茶的化學成分及入血成分

王宏蕾 肖 薇 吳劍坤

首都醫科大學附屬北京中醫醫院藥學部，北京 100010

益氣生津袋泡茶由西洋參、生黃芪、麥冬、石斛等 十味中藥組成，為一種茶散劑[1]，具有益氣養陰、生津止渴，潤肺清胃，滋腎寧心的功效，為首都醫科大學附屬北京中醫醫院院內制劑，由王為蘭、夏軍及毛克臣三位中醫藥專家在糖尿病氣陰虧虛的中醫病機研究基礎上研制而成，臨床應用30 余年。研究證實，其在改善糖代謝及治療干燥綜合征等方面取得了較好的效果[2-5]。但是目前尚未開展其化學成分相關研究，藥效物質基礎仍不明確。分析入血成分可快速、準確地解析中藥藥效物質，也是中藥質量標志物篩選的重要依據，是快速確定中藥體內藥效物質的有效途徑之一[6-8]。基于此，鑒定益氣生津袋泡茶的化學成分及入血成分成為重中之重。液質聯用技術以其快捷、高靈敏度、高分辨率等特點被廣泛應用于中藥原型成分與代謝產物的鑒別[9-11]。因此，本研究采用HPLC-Q-TOF-MS 技術對益氣生津袋泡茶的化學成分進行鑒定，并在此基礎上對其入血成分進行分析表征，以期為益氣生津袋泡茶的質量控制和藥效物質基礎的研究提供依據。

1 儀器與試藥

1.1 實驗儀器

Agilent 1200 型高效液相色譜柱儀（美國Agilent公司）；TripleTOF 5 600 四級桿飛行時間質譜（美國AB Sciex 公司）；BT25S 型電子分析天平（精度0.01 mg，德國Sartorius 公司）；BSA6202S 電子分析天平（精度0.01 g，Sartorius 公司）；1-15PK 型高速冷凍離心機（德國Sigma 公司）；CM-12 型水浴氮吹儀（北京成萌偉業科技有限公司）。

1.2 藥品與試劑

益氣生津袋泡茶為首都醫科大學附屬北京中醫醫院自制；毛蕊異黃酮葡萄糖苷（成都普菲德生物技術有限公司，批號：140326）；人參皂苷Re（上海源葉生物科技有限公司，批號：P27N6F6512）；甜菜堿、人參皂苷Rb1、人參皂苷Rg1（中國食品藥品檢定研究院，批號：110894-201604、110704-201223、110703-201128）；哈巴俄苷、哈巴苷、毛蘭素（南京狄爾格醫藥科技有限公司，批號：D22052910、D22062177、D21080111）。色譜級甲酸、甲醇和乙腈（美國Fisher 公司）。

1.3 實驗動物

8 周齡SPF 級SD 雄性大鼠6 只，體重280～300 g，購于斯貝福（北京）生物技術有限公司，實驗動物生產許可證號為：SCXK（京）2019-0010，質量合格證號為：No.110324221103743637。本研究涉及的實驗動物方案已得到北京中醫藥大學實驗動物倫理委員會的批準（BUCM-4-2022061502-2062）。

2 方法與結果

2.1 溶液制備

2.1.1 益氣生津袋泡茶水提物制備稱取益氣生津袋泡茶內容物100.13 g，加8 倍量去離子水，回流提取2次，每次30 min，紗布濾過，合并兩次提取液，50℃水浴蒸至稠膏狀，轉移至50 ml 量瓶中，離子水定容，得生藥濃度為2 g/ml 的水提物稠膏，-20℃保存。分析前，取稠膏適量，稀釋40 倍，0.22 μm 濾膜過濾，取續濾液，即得。

2.1.2 灌胃液制備取“2.1.1”項制備的水提物稠膏適量，用0.5%羧甲基纖維素鈉溶液制成生藥質量濃度為1 g/ml 的混懸液，4℃儲存，作為灌胃液備用。

2.1.3 混合對照品溶液制備 分別精密稱取9.78 mg 毛蕊異黃酮葡萄糖苷、8.93 mg 甜菜堿、9.34 mg 人參皂苷Rb1、10.02 mg 人參皂苷Rg1、9.53 mg 人參皂苷Re、9.64 mg 哈巴俄苷、9.71 mg 哈巴苷、11.33 mg 毛蘭素，加甲醇超聲溶解并稀釋，制成濃度約為10 μg/ml 的混合對照品溶液。

2.2 動物實驗

采用隨機數字表法將6 只大鼠分為給藥組與空白組，每組3 只。給藥組灌胃4 ml 益氣生津袋泡茶灌胃液，空白組灌胃4 ml 生理鹽水，2 次/d，連續給藥，第4 天上午給藥2 h 后麻醉大鼠，腹主動脈采血并置于4℃以備后續處理分析。

2.3 血漿樣品處理

血漿樣品分裝于離心管中，4℃，3 500 r/min 離心15 min（離心半徑為10 cm，下同），取上清液，加入等體積乙腈沉淀蛋白，渦旋混勻2 min，4℃10 000 r/min離心10 min，吸取上清液用氮吹儀吹干，加50%甲醇200 μl 復溶，4℃，10 000 r/min 離心10 min，取上清液上樣分析。

2.4 色譜條件與質譜條件

2.4.1 色譜條件WatersXselectHSST3C18色譜柱（50mm×2.1 mm，2.5 μm）；流動相為0.1%甲酸（A）-乙腈（B），梯度洗脫：0～3 min，15%B；3～6 min，15%B →35%B；6～17 min，35%B→65%B；17～18 min，65%B→95%B；18～22 min，95%B；22～23 min，95%B→15%B；23～27 min，15%B。柱溫40℃，流速0.3 ml/min，進樣體積3 μl。

2.4.2 質譜條件 電噴霧離子源；分別采用正、負離子模式檢測；質量掃描范圍為m/z 100～1 300；噴霧電壓4 500 V；離子化溫度500℃；碰撞能量35 eV；氣簾氣30 psi；噴霧氣和輔助加熱氣分別為40、50 psi；去簇電壓100 V。

2.5 益氣生津袋泡茶提取物中化學成分鑒定

采用Analyst 1.7 軟件進行質譜數據采集與分析，對照品溶液與水提物的總離子流圖見圖1。通過質譜裂解碎片分析、對照品確認及相關文獻[12-13]報道數據進行比對，共鑒定出17 種化學成分，包括1 個生物堿類成分、1 個黃酮苷類成分、1 個甾體皂苷元、2 個環烯醚萜苷類成分與12 個人參皂苷類成分。鑒定出的化學成分的詳細信息見表1。

表1 益氣生津袋泡茶中成分的鑒定結果

圖1 總離子流圖

化合物鑒定時，其中8 個化合物經對照品比對后確認，剩余9 個化合物通過與文獻報道的質量數與二級譜數據對比后鑒定。以化合物4 的鑒定過程為例進行詳細的說明。化合物4 在負離子模式下準分子離子峰m/z 為783.488 5[M-H]-，元素組成分析，推測該化合物的分子式為C42H72O13（-0.5 ppm）；其特征離子峰為連續脫去兩分子葡萄糖生成m/z=621[M-H-Glu]-和459[M-H-2Glu]-，以及苷元上C-20 位脫掉側鏈后的碎片離子m/z=375[M-H-2Glu-C6H12]-，與人參二醇型皂苷[14]的裂解規律一致，且二級譜數與人參皂苷F2一致[12]，因此推測該化合物為人參皂苷F2。

2.6 益氣生津袋泡茶入血成分鑒定

給藥組大鼠的血清樣品中共鑒定出8 個原型吸收入血的成分，分別為甜菜堿、人參皂苷Rg1、人參皂苷Re、哈巴俄苷、擬人參皂苷F11、人參皂苷Rb1、人參皂苷Rd、毛蘭素，其中5 個人參皂苷類成分均來源于西洋參。

3 討論

益氣生津袋泡茶臨床用量為10～30 g 生藥/d，基于人體平均重量60 kg 及人與大鼠劑量換算（系數6.3），280 g 大鼠給藥劑量應為1.5～4.5 g 生藥/d。而本研究中給藥劑量為8 g/d，約為臨床給藥劑量的2倍，是考慮到體內血中成分的含量往往很低，目前的技術存在檢測困難的問題。因此，在保證給藥劑量安全的情況下，通過提高給藥濃度及3 d 多次給藥的方式，增加血中成分的濃度，以滿足檢測的要求。此外，由于中藥復方中化學成分復雜，常包含多種類型的化學成分，而有些化學成分在正、負離子模式下的響應差異較大[15-17]，同時，復方中各化學成分的含量存在顯著差異[18-20]。因此，為了實現對復方中化學成分進行較全面的表征，本研究分別采用正、負離子模式采集，對益氣生津袋泡茶的主要化學成分進行定性識別。

目前研究表明，西洋參總皂苷[21-22]及多種人參皂苷單體如人參皂苷Re、Rg1、Rb1、Rg2 等能通過改善胰島素抵抗，增強葡萄糖攝取，抑制葡萄糖輸出，抑制肝臟糖異生及緩解糖脂代謝等途徑來調節機體的糖代謝[23-25]。而本研究發現，益氣生津袋泡茶中含有豐富的人參皂苷類成分，且多種皂苷被發現均能以原型方式入血（如人參皂苷Rb1、Re）。推測這些成分可能是益氣生津袋泡茶改善糖代謝功效的物質基礎。綜上，本研究基于HPLC-Q-TOF-MS 技術對益氣生津袋泡茶中的主要活性成分進行快速識別，為明確其藥效物質基礎提供了一定的科學依據，也為該藥的質量控制、劑型改進及進一步臨床研究奠定了理論基礎。