基于TLRs/ NF-κB 信號通路觀察不同滑膜細胞來源炎性外泌體對家兔膝關節(jié)的影響及其作用機制

周 俊 郭長青 王慶甫

1.北京中醫(yī)藥大學研究生院，北京 100029；2.北京中醫(yī)藥大學針灸推拿學院，北京 100029；3.北京中醫(yī)藥大學第三附屬醫(yī)院筋傷科，北京 100029

膝骨關節(jié)炎（knee osteoarthritis，KOA）是一種以膝關節(jié)疼痛、畸形、僵硬和功能障礙為主要癥狀的下肢骨退行性病變，是導致下肢殘疾的十大常見疾病之一[1-5]。TLRs/NF-κB 通路介導的滑膜炎癥是KOA 的主要病理變化[6-9]。然而KOA 滑膜炎癥的發(fā)病機制目前尚不明確。外泌體是由細胞分泌的脂質(zhì)雙層膜小囊泡，可通過其富含的各類miRNA 對于Toll 樣受體2（Toll-like receptor，TLR2）的抑制作用，調(diào)控TLRs/NF-κB 信號通路，參與炎癥反應過程[10-13]。本研究擬通過動物實驗，觀察滑膜組織兩種主要組成細胞的炎性外泌體對于家兔膝關節(jié)滑膜組織的影響，探討在KOA 滑膜炎癥過程中兩種滑膜細胞來源外泌體對于TLRs/NF-κB通路的調(diào)控作用。

1 對象與方法

1.1 實驗動物

健康成年家兔20 只，體重2.0～2.5 kg，購自北京金牧陽實驗動物養(yǎng)殖有限公司，許可證號：SCXK（京）2015-0005。所有家兔均飼養(yǎng)于中國中醫(yī)科學院醫(yī)學動物實驗中心。清潔級飼養(yǎng)，實驗室平均室溫（22±1）℃，空氣濕度40%～50%。本實驗通過中國中醫(yī)科學院動物護理和使用委員會批準（20193003）。按照《實驗動物護理和使用指南》福利倫理嚴格執(zhí)行。

1.2 主要試劑

人成纖維樣滑膜細胞系及巨噬樣滑膜細胞系（上海ATCC 細胞庫，批號：BFN680323）；DMEM 培養(yǎng)基、胎牛血清（invitrogen，批號：C111965500BT）；脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）（Sigma 公司，批號：L2880）；外泌體提取收集試劑盒（北京恩澤康泰生物科技有限公司，批號：211-9053）；兔基質(zhì)金屬蛋白酶-13（matrix metallo proteinase，MMP-13）、腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor，TNF-α）、白細胞介素-1β（interleukin，IL-1β）、IL-6、酶聯(lián)免疫吸附試驗法試劑盒（abcam，批號：abc187235）；TLR-2、核轉錄因子NF-κB、髓樣分化因子-88（myeloid differentiation factor-88，MyD88）、TNF 受體相關因子2（TNF receptor-associated factor 2，traf2）單克隆抗體（abcam，批號：abc434852）；二甲苯、石蠟（北京北化公司，批號：14052930）；蘇木精-伊紅染色試劑（Sigma 公司，批號：Y00030）。

1.3 實驗方法

1.3.1 滑膜細胞炎性外泌體提取 將兩種滑膜細胞復蘇后常規(guī)培養(yǎng)。取3～4 代細胞，加入5 μl LPS/PBS 溶液（1 μg/ml）干預24 h 后收集兩種細胞的上清液，利用試劑盒提取上清液中外泌體，將外泌體與生理鹽水制備成混懸液（濃度為1×107/ml）并置于-80℃下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 家兔分組及干預 用隨機數(shù)字表法將20 只家兔分為正常組、鹽水組、A 組、B 組、A+B 組。正常組不予處理，A 組于右膝關節(jié)腔注射A 細胞外泌體混懸液、B 組注射B 細胞外泌體混懸液、A+B 組注射兩種外泌體混合混懸液（兩種混懸液按1∶1 混合），鹽水組僅注射生理鹽水。3 次/周，每次0.5 ml，連續(xù)注射2 周。

1.4 觀察指標及方法

1.4.1 行為學 干預后2 周，采用改良膝骨關節(jié)炎嚴重程度指數(shù)（Lequesne MG）對各組家兔局部疼痛、步態(tài)改變、關節(jié)活動范圍和關節(jié)腫脹程度的刺激反應情況進行評估，記錄總評分[14]。

1.4.2 各組家兔血清中TNF-α、IL-1β、IL-6 及MMP-13 水平 將各組家兔用10%水合氯醛（2 ml/kg）耳緣靜脈注射麻醉后，用采血針采集腹主動脈血15 ml，用半徑10cm 的超速離心機4℃、3000r/min 離心10min后，取上清液，應用試劑盒檢測各組血清中TNF-α、IL-1β、IL-6 及MMP-13 水平。

1.4.3 蛋白質(zhì)印跡法檢測滑膜組織中TLR2、P65、MyD88、traf2 蛋白表達 取10 mg 滑膜組織，剪碎研磨后加入0.2 ml 的蛋白裂解液和蛋白酶抑制劑混合液；4℃低溫離心機，12 000 r/min 離心15 min 后，取清液置于新EP 管中，并進行標記分組。用BCA 試劑盒進行蛋白濃度測定，取適量蛋白進行電泳，電泳完成后進行電轉，將目標蛋白轉移至PVDF 膜上，將膜完全浸沒在3% BSA-TBST 中室溫輕搖30 min。用3%BSA-TBST 稀釋一抗，參照TLR2、P65、MyD88、traf2及內(nèi)參β-actin 等抗體說明書進行一抗標記，TBST 清洗4 次后，加入二抗室溫孵育1 h，最后加入ECL 試劑后顯影。

1.5 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 22.0 統(tǒng)計學軟件進行數(shù)據(jù)分析。計量資料采用均數(shù)±標準差（）表示，兩組間比較采用獨立樣本t 檢驗；多組間比較采用單因素方差分析（One-way ANOVA）。以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 各組家兔行為學Lequesne MG 指數(shù)

正常組及鹽水組干預前后Lequesne MG 分比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。A、B、A+B 組干預后Lequesne MG 指數(shù)均高于干預前，且A+B 且高于A組、B 組（P＜0.05）。見表1。

表1 各組家兔行為學Lequesne MG 指數(shù)比較（）

表1 各組家兔行為學Lequesne MG 指數(shù)比較（）

注 與A+B 組比較，aP＜0.05。

2.2 各組家兔血清中TNF-α、IL-1β、IL-6 及MMP-13 水平比較

正常組與鹽水組家兔血清中TNF-α、IL-1β、IL-6 及MMP-13 水平比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；A、B、A+B 組家兔血清中TNF-α、IL-1β、IL-6及MMP-13 水平高于正常組和鹽水組（P＜0.05）；A+B組家兔血清中TNF-α、IL-1β、IL-6 及MMP-13 水平高于A 組和B 組（P＜0.05）。見表2。

表2 各組家兔血清中TNF-α、IL-1β、IL-6 及MMP-13 表達水平比較（ng/L，）

表2 各組家兔血清中TNF-α、IL-1β、IL-6 及MMP-13 表達水平比較（ng/L，）

注 與正常組比較，aP＜0.05；與A 組比較，bP＜0.05；與B 組比較，cP＜0.05。TNF-α：腫瘤壞死因子-α；IL-1β：白細胞介素-1β；IL-6：白細胞介素-6；MMP-13：基質(zhì)金屬蛋白酶-13。

2.3 各組家兔滑膜組織中TLR2、P65、MyD88、traf2 蛋白表達量比較

正常組與鹽水組TLR2、P65、MyD88、traf2 蛋白比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；A、B、A+B 組滑膜組織中TLR2、P65、MyD88、traf2 蛋白表達量均高于正常組（P＜0.05），其中A+B 組滑膜組織中TLR2、P65、MyD88、traf2 蛋白表達量高于A 組和B 組（P＜0.05），而A 組滑膜組織中TLR2、P65、MyD88、traf2 蛋白表達量高于B 組（P＜0.05）。見圖1、表3。

圖1 各組家兔膝關節(jié)滑膜組織中TLRs/NF-κB 通路相關蛋白條帶圖

表3 各組家兔滑膜組織中TLRZ、P65、MyD88、traf2 蛋白表達量比較（）

表3 各組家兔滑膜組織中TLRZ、P65、MyD88、traf2 蛋白表達量比較（）

注 與正常組比較，aP＜0.05；與A 組比較，bP＜0.05；與B 組比較，cP＜0.05。TLR2：Toll 樣受體2；MyD88：髓樣分化因子-88；traf2：TNF 受體相關因子2。

3 討論

正常人體膝關節(jié)滑膜由內(nèi)膜層和內(nèi)膜下層組成，內(nèi)膜層主要由A 型巨噬細胞樣滑膜細胞（macrophage-like synoviocytes，MLC）、B 型成纖維細胞樣滑膜細胞（fibroblast-like synoviocytes，F(xiàn)LC）構成。兩者功能不同，A 細胞具有清除代謝產(chǎn)物，分泌炎癥因子的作用；B 細胞主要功能是分泌透明質(zhì)酸，調(diào)節(jié)關節(jié)液平衡[15-18]。NF-κB 是在炎癥反應中處于核心地位的核轉錄因子，其在細胞中最常見的家族成員是P65 和P50。各種因素產(chǎn)生的體內(nèi)損傷相關分子模式可以使Toll樣受體（如TLR2、TLR4）激活，激活后的TLR2 可以與銜接蛋白（如MyD88、traf2 等）結合形成復合物，并通過一系列反應激活TLRs/NF-κB 信號通路，從而釋放各種下游炎癥因子如TNF-α、IL-1β、IL-6 和MMP-13等，引起滑膜固有免疫反應[19-21]。外泌體可以攜帶其來源細胞的蛋白質(zhì)、脂質(zhì)及核酸等信息物質(zhì)，并與附近的受體細胞進行生物信號的傳遞，影響局部微環(huán)境，調(diào)節(jié)相關蛋白表達及調(diào)控相關生物學過程[22]。

在本研究中，A、B、A+B 組外泌體干預后的家兔行為學Lequensne MG 指數(shù)高于干預前（P＜0.05），并且在外泌體干預后家兔關節(jié)出現(xiàn)輕度腫脹，這說明關節(jié)內(nèi)出現(xiàn)了炎癥反應。酶聯(lián)免疫吸附試驗法及蛋白質(zhì)印跡法檢測結果提示兩種滑膜細胞來源的炎性外泌體均可激活家兔滑膜TLRs/NF-κB 信號通路，引起滑膜炎癥反應，并進一步損傷軟骨，引起家兔的形態(tài)學改變。其中蛋白質(zhì)印跡法顯示A 細胞外泌體干預后的滑膜組織中相關蛋白表達量高于B 細胞，提示A細胞外泌體比B 細胞外泌體含有更多的促炎因子。外泌體主要攜帶來自母細胞的蛋白及其他物質(zhì)，在KOA 中，A 細胞在損傷相關分子模式的刺激下不僅釋放促炎因子，而且會釋放多種黏附分子，如血管細胞黏附分子-1 等[23]；B 細胞是源于骨髓中的巨噬細胞，當局部產(chǎn)生炎癥時，不僅出現(xiàn)B 細胞增殖，而且大量循環(huán)系統(tǒng)中的巨噬細胞在血管細胞黏附分子-1 的作用下被募集到滑膜組織中[24]，產(chǎn)生局部免疫反應，同時釋放的炎癥因子又可以進一步促進成纖維細胞增生和產(chǎn)生炎癥[24-25]。可見在KOA 中，A 細胞是主要的炎癥效應細胞，兩種細胞不僅都會產(chǎn)生炎癥因子，而且可以通過各自分泌的外泌體在兩者之間形成正反饋調(diào)節(jié)，互相促進炎癥程度導致KOA 的進一步加重。

綜上，在KOA 疾病進展過程中，兩種滑膜細胞外泌體均可以激活滑膜中TLRs/NF-κB 信號通路，加重KOA 的炎癥程度。為進一步認識和研究KOA 發(fā)病機制提供了新的思路和研究基礎。