基于PERK/ Nrf2 通路探討復(fù)方芪鷹顆粒治療糖尿病周圍神經(jīng)病變的機制

陳 臣 胡 燕 劉 濤 胡曉靈

1.新疆醫(yī)科大學(xué)第四臨床醫(yī)學(xué)院，新疆烏魯木齊 830011；2.新疆維吾爾自治區(qū)中醫(yī)醫(yī)院，新疆烏魯木齊 830000

糖尿病周圍神經(jīng)病變（diabetic peripheral neuropathy，DPN）是糖尿病最常見、最復(fù)雜的并發(fā)癥之一，發(fā)病率達(dá)50%[1]。臨床上DPN 常累及患者的感覺和運動神經(jīng)，產(chǎn)生肢體麻木、疼痛等感覺障礙，甚至導(dǎo)致肌肉無力及萎縮，嚴(yán)重影響患者的生存質(zhì)量[2-3]，威脅患者的生命安全[4-5]。在治療方面，由于病因不明，目前西藥僅對癥治療且只有短期效果[6-7]，與中醫(yī)藥效果比較仍顯不足[8]。復(fù)方芪鷹顆粒是全國名中醫(yī)胡曉靈的經(jīng)驗方，亦為新疆維吾爾自治區(qū)中醫(yī)醫(yī)院院內(nèi)制劑，前期臨床研究發(fā)現(xiàn)，該方能有效改善運動正中神經(jīng)、感覺正中神經(jīng)、感覺腓總神經(jīng)傳導(dǎo)速度，還具有升高血管內(nèi)皮生長因子及胰島素樣生長因子-1 的作用，臨床有效率達(dá)87.9%[9-10]。蛋白激酶RNA 樣內(nèi)質(zhì)網(wǎng)激酶（protein kinase RNA-like endoplasmic reticulum kinase，PERK）介導(dǎo)的C/EBP 同源蛋白（C/EBP homologous protein，CHOP）途徑是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激（endoplasmic reticulum stress，ERS）誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡主要途徑之一，抑制PERK 介導(dǎo)的核轉(zhuǎn)錄因子紅系2 相關(guān)因子2（nuclear factor-erythroid 2-related factor 2，Nrf2）核轉(zhuǎn)位/轉(zhuǎn)錄激活因子4（activating transcription factor 4，ATF4）/CHOP途徑能夠減輕細(xì)胞凋亡[11]。目前研究發(fā)現(xiàn)，PERK/Nrf2通路在DPN 中發(fā)揮重要作用[12]。因此，本研究擬從PERK/Nrf2 通路為切入點，探討復(fù)方芪鷹顆粒治療DPN 的分子機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及藥物

72 只雄性8 周齡SPF 級Wistar 大鼠，體重180～220 g，購于新疆醫(yī)科大學(xué)動物中心[動物許可證號：SCXK（新）2018-0002]。復(fù)方芪鷹顆粒購于新疆維吾爾自治區(qū)中醫(yī)醫(yī)院（ZJ2012006），7.5 g/袋；三甲胺N-氧化物，購于Sigma，貨號為317594-1G。本研究經(jīng)新疆醫(yī)科大學(xué)實驗動物倫理委員會審批（IACUC20200930-9）。

1.2 主要試劑與儀器

鏈脲菌素（Streptozotocin，STZ）（美國Sigma，S0130-1G）、蘇木精染液（福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司，CTS-1097）、伊紅染液（北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，ZLI-9613）、GRP78（美國CST，3183S）、p-PERK（美國CST，3179S）、PERK（CST，3192S）、Nrf2（美國abcam，Ab89443）、ATF4（美國CST，11815S）、胱天蛋白酶-3（cysteine aspartic acid specific protease-3，caspase-3）（美國abcam，Ab184787）、CHOP（美國CST，2895S）、二抗山羊抗兔IgG H&L（美國abcam，Ab205718）、二抗山羊抗小鼠IgG H&L（美國abcam，Ab205719）、流式細(xì)胞儀（美國BD，LSRFortessa）、蛋白轉(zhuǎn)膜儀（美國Bio-Rad，Mini-PROTEAN Tetra system）、血糖儀（瑞士羅氏Accu-Chek，卓越型）。

1.3 DPN 大鼠模型構(gòu)建

造模參照課題組前期研究[13-14]，造模大鼠持續(xù)喂45%高脂飼料（江蘇協(xié)同醫(yī)藥生物工程有限公司，XTHF45-1）8 周后，注射小劑量鏈脲佐菌素30 mg/kg造糖尿病模型。選取空腹血糖＞11.1 mol/L 的大鼠作為糖尿病模型大鼠繼續(xù)高脂飲食4 周后，用Meditronic keypoint-4 workstation 肌電圖儀評估DPN 造模情況，以下肢坐骨神經(jīng)感覺或運動傳導(dǎo)速度減慢≥11%為造模成功。

1.4 分組與給藥

將實驗動物采用計算機隨機數(shù)字法分為正常對照組、模型組、陽性藥組及復(fù)方芪鷹顆粒低、中、高劑量組，每組12 只。模型組、陽性藥組及復(fù)方芪鷹顆粒低、中、高組構(gòu)建DPN 大鼠模型，造模成功后復(fù)方芪鷹顆粒低、中、高劑量組分別予以復(fù)方芪鷹顆粒1.17、2.34、4.68 g/kg[14]，陽性藥組予以氧化三甲胺110 mg/kg，2 ml/次，灌胃1 次/d，模型組及正常對照組給予等量的雙蒸水。干預(yù)時間為4 周，期間各組自由進食和水。

1.5 血糖測定及蘇木精-伊紅染色

在DPN 造模成功后及藥物干預(yù)4 周后，取大鼠尾部血，用Accu-Chek 血糖儀測血糖。在末次給藥后，所有大鼠禁食12 h，用3%戊巴比妥鈉（50 mg/kg）充分麻醉，俯臥位固定于手術(shù)臺上，手術(shù)留取坐骨神經(jīng)標(biāo)本[15]，并將組織一部分置于10%福爾馬林溶液，一部分置于凍存管內(nèi)，液氮速凍后于-80℃凍存?zhèn)溆谩?0%福爾馬林溶液中坐骨神經(jīng)標(biāo)本固定1 周后，進行石蠟包埋，最后切制成約5 μm 切片。按照蘇木精-伊紅染色試劑盒上說明進行操作，分別在40、100、200及400 倍顯微鏡下觀察大鼠坐骨神經(jīng)病理學(xué)改變。

1.6 蛋白質(zhì)印跡法檢測相關(guān)蛋白

根據(jù)課題組前期實驗方法[15]對各組坐骨神經(jīng)組織進行蛋白質(zhì)印跡法檢測。一抗孵育：GRP78（1∶1 000稀釋）、PERK（1∶800 稀釋）、p-PERK（1∶600 稀釋）、ATF4（1∶800 稀釋）、Nrf2（1∶800 稀釋）、CHOP（1∶800稀釋）、caspase-3（1∶1 000 稀釋）、β-actin（1∶1 000稀釋）。二抗兔抗（R）1∶5 000 稀釋，鼠抗（M）1∶15 000稀釋。采用ChemiScope mini 化學(xué)發(fā)光儀檢測、拍照，用Image Lab 圖像分析。

1.7 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 23.0 統(tǒng)計學(xué)軟件進行數(shù)據(jù)分析。計量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，兩組比較采用t 檢驗。多組計量資料比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t 檢驗。以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

整個實驗過程中，最終完成實驗動物為46 只，其中正常對照組12 只、模型組6 只、復(fù)方芪鷹顆粒低劑量組6 只、復(fù)方芪鷹顆粒中劑量組6 只、復(fù)方芪鷹顆粒高劑量組8 只、陽性對照組8 只。

2.1 六組坐骨神經(jīng)蘇木精-伊紅染色

鏡下觀察可見，正常對照組有髓神經(jīng)纖維結(jié)構(gòu)完整、分布均勻、排列規(guī)則，軸索、髓鞘及神經(jīng)膜形態(tài)結(jié)構(gòu)良好、完整，神經(jīng)內(nèi)膜形態(tài)結(jié)構(gòu)正常；模型組有髓神經(jīng)纖維脫失、減少，部分排列紊亂，部分軸索變性，節(jié)段性脫髓鞘，神經(jīng)膜增厚，神經(jīng)內(nèi)膜膠原纖維增生；與模型組比較，復(fù)方芪鷹顆粒低、中、高劑量組髓神經(jīng)纖維軸索變性、脫髓鞘、神經(jīng)膜增厚及神經(jīng)內(nèi)膜增生程度均減輕。見圖1。

圖1 六組坐骨神經(jīng)蘇木精-伊紅染色

2.2 六組DPN 造模成功后及藥物干預(yù)4 周后血糖水平比較

DPN 造模成功后，模型組血糖高于正常對照組（P＜0.05），復(fù)方芪鷹顆粒低、中、高劑量組血糖與模型組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。藥物干預(yù)4周后，模型組血糖高于正常對照組，復(fù)方芪鷹顆粒低、中、高劑量組血糖低于模型組，復(fù)方芪鷹顆粒中、高劑量組血糖低于復(fù)方芪鷹顆粒低劑量組（P＜0.05）。見表1。

表1 六組DPN 造模成功后及藥物干預(yù)4 周后血糖水平比較（mmol/L，）

表1 六組DPN 造模成功后及藥物干預(yù)4 周后血糖水平比較（mmol/L，）

注 與正常對照組同期比較，aP＜0.05；與模型組同期比較，bP＜0.05；與復(fù)方芪鷹顆粒低劑量組同期比較，cP＜0.05。DPN：糖尿病周圍神經(jīng)病變。

2.3 六組坐骨神經(jīng)GRP78、PERK、p-PERK、ATF4、Nrf2、CHOP、caspase-3 表達(dá)比較

模型組坐骨神經(jīng)組織GRP78、p-PERK、ATF4、CHOP、caspase-3 高于正常對照組，Nrf2 低于正常對照組（P＜0.05）。復(fù)方芪鷹顆粒中、高劑量組GRP78、ATF4、CHOP 低于模型組，Nrf2 高于模型組；復(fù)方芪鷹顆粒高劑量組p-PERK、caspase-3 低于模型組（P＜0.05）。復(fù)方芪鷹顆粒高劑量組ATF4、CHOP 低于復(fù)方芪鷹顆粒低劑量組，復(fù)方芪鷹顆粒中劑量組CHOP 低于復(fù)方芪鷹顆粒低劑量組（P＜0.05）。見圖2、表2。

圖2 六組坐骨神經(jīng)GRP78、PERK、p-PERK、ATF4、Nrf2、CHOP、caspase-3 表達(dá)條帶圖

表2 六組坐骨神經(jīng)GRP78、PERK、p-PERK、ATF4、Nrf2、CHOP、caspase-3 表達(dá)比較（mmol/L，）

表2 六組坐骨神經(jīng)GRP78、PERK、p-PERK、ATF4、Nrf2、CHOP、caspase-3 表達(dá)比較（mmol/L，）

注 與正常對照組比較，aP＜0.05；與模型組比較，bP＜0.05；與復(fù)方芪鷹顆粒低劑量組比較，cP＜0.05。GRP78：葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78；PERK：蛋白激酶RNA 樣內(nèi)質(zhì)網(wǎng)激酶；p：磷酸化；ATF4：轉(zhuǎn)錄激活因子4；Nrf2：核轉(zhuǎn)錄因子紅系2 相關(guān)因子2；CHOP：C/EBP 同源蛋白；caspase-3：胱天蛋白酶-3。

3 討論

中醫(yī)藥在改善DPN 患者的血糖、臨床癥狀及生活質(zhì)量方面有著重要的作用[16-23]，復(fù)方芪鷹顆粒是胡曉靈主任醫(yī)師經(jīng)驗方，應(yīng)用于糖尿病周圍神經(jīng)病變治療效果顯著[14，24]。DPN 既有消渴，又有痿痹，以氣陰虧虛為主證，兼以痰瘀阻滯、風(fēng)伏絡(luò)瘀。本方取黃芪為君藥，而臣以黃精、鷹嘴豆，佐以丹參、蟬蛻，共成益氣養(yǎng)陰、祛瘀化痰、疏風(fēng)通絡(luò)之制，實為治療消渴痿痹之良劑。同時，消渴痿痹病機特點為氣陰兩虛，痰濁瘀血阻滯，風(fēng)伏絡(luò)脈，本方氣、血、風(fēng)藥俱備，尤側(cè)重于治氣，獨無祛痰藥，但補氣即可以祛痰，而祛瘀、活血、疏風(fēng)，又使痰濁失卻合邪之停留，自能令痰濁消除，這正是本方配伍精當(dāng)簡約之處。

目前研究發(fā)現(xiàn)，ERS 是DPN 發(fā)病的重要病理機制，亦是治療該病的全新藥物靶點[25-27]。以此為線索，前期本課題組進行了初步動物實驗探索發(fā)現(xiàn)，復(fù)方芪鷹顆粒能夠提高外周神經(jīng)中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)分子伴侶免疫球蛋白重鏈結(jié)合蛋白質(zhì)同源的Hsp70 表達(dá)水平，減少神經(jīng)受損程度[14]。該藥可能提高了分子伴侶蛋白的表達(dá)，減少未折疊蛋白數(shù)量，參與了內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激過程。據(jù)此，本研究以ERS 相關(guān)的PERK/Nrf2 通路為切入點，探討復(fù)方芪鷹顆粒治療DPN 的分子機制。在PERK/CHOP 通路介導(dǎo)的DPN 凋亡研究中，ERS 參與DPN過程并誘導(dǎo)了外周神經(jīng)的凋亡[28]。在DPN 的體內(nèi)外ERS 實驗研究中，促凋亡蛋白CHOP 和抑制凋亡蛋白ORP150 存在密切聯(lián)系，且CHOP/ORP150 比值在DNP 病情的不同階段起著不同的作用[27]。在基于ERS 的中藥復(fù)方治療DPN 的研究中，糖絡(luò)寧湯劑治療效果明顯優(yōu)于對照組，其作用機制是該方介導(dǎo)了ERS 中PERK/Nrf2 及PERK/CHOP/caspase-12 通路發(fā)揮抗凋亡的作用[12，29]。PERK/Nrf2 通路是ERS 的主要通路，且在防止施萬細(xì)胞凋亡方面發(fā)揮重要作用[30]。本研究結(jié)果顯示，復(fù)方芪鷹顆粒干預(yù)后大鼠坐骨神經(jīng)觀察到髓神經(jīng)纖維軸索變性、脫髓鞘、神經(jīng)膜增厚及神經(jīng)內(nèi)膜增生程度均減輕，血糖降低，坐骨神經(jīng)中GRP78、p-PERK、ATF4、CHOP、caspase-3 表達(dá)水平有顯著下調(diào)，Nrf2 表達(dá)水平上調(diào)。

綜上所述，復(fù)方芪鷹顆粒對DPN 大鼠的神經(jīng)保護及降糖作用機制可能是該藥抑制了PERK/Nrf2 通路，減輕了ERS，防止了大鼠坐骨神經(jīng)有髓神經(jīng)纖維軸索變性、脫髓鞘、神經(jīng)膜增厚及神經(jīng)內(nèi)膜增生程度。該研究豐富了復(fù)方芪鷹顆粒藥效學(xué)內(nèi)容，為今后研究DNP 的防治奠定一定的理論基礎(chǔ)，也為DPN 治療提供一種可選藥物。