水質(zhì)樣品的色度對酶底物法測定總大腸菌群、糞大腸菌群的影響

鄺小林

（西安市環(huán)境衛(wèi)生科學研究所，陜西 西安 710075）

根據(jù)HJ 1001—2018《水質(zhì) 總大腸菌群、糞大腸菌群和大腸埃希氏菌的測定 酶底物法》標準的規(guī)定，總大腸菌群和糞大腸菌群是指分別在37 ℃和44.5 ℃培養(yǎng)24 h能產(chǎn)生β-半乳糖苷酶，分解選擇性培養(yǎng)基中的鄰硝基苯-β-吡喃半乳糖苷生成黃色鄰硝基苯酚的腸桿菌科細菌[1]，總大腸菌群和糞大腸菌群是水質(zhì)檢測中的重要指標之一，常用于衡量水質(zhì)污染程度和致病風險。目前，我國用于水質(zhì)總大腸菌群和糞大腸菌群的快速檢測方法有很多，例如紙片法、濾膜法、酶底物法等，但是由于酶底物法易于操作、靈敏性高、準確率高、費用少的特點，被普遍用于水質(zhì)總大腸菌群和糞大腸菌群的快速檢測中[2]。

然而，針對地下水、地表水和生活污水和工廠廢水中總大腸菌群和糞大腸菌群測定，標準HJ 1001—2018雖然規(guī)定了根據(jù)水質(zhì)樣品污染程度來確定接種量來減少水質(zhì)樣品色度對菌群檢測結(jié)果的影響，但是水質(zhì)樣品色度較深也會影響陽性孔數(shù)的判讀以及檢測結(jié)果的準確性[1]。與此同時，水質(zhì)色度對于水質(zhì)檢測存在干擾[3]，但是關(guān)于水質(zhì)樣品色度對酶底物法測定總大腸菌群和糞大腸菌群的具體影響，至今還未見相關(guān)研究。鑒于此，為了深入探究水質(zhì)樣品的色度變化對總大腸菌群和糞大腸菌群測定的影響，本文設(shè)置了5個水質(zhì)樣品色度，采用酶底物法對其總大腸菌群和糞大腸菌群數(shù)值進行測定，并利用統(tǒng)計分析法對其差異進行了科學評估。

1 菌株與方法

1.1 菌株

本實驗采用的總大腸菌群和糞大腸菌群（HJQC-004）購買于中國工業(yè)微生物菌種保藏中心。

1.2 試劑與儀器

1.2.1 試劑

本實驗采用的科立得酶底物培養(yǎng)基和標準陽性比色盤均購買于美國愛德士生物科技公司；無菌水由實驗室純水儀并經(jīng)高壓蒸汽滅菌（121 ℃，20 min）制得。

1.2.2 儀器

本實驗采用的實驗儀器：97孔定量盤（美國愛德士生物科技公司）；程控定量封口機（美國愛德士生物科技公司）；恒溫培養(yǎng)箱（上海科恒實業(yè)發(fā)展有限公司）；半自動高壓蒸汽滅菌鍋（上海申安醫(yī)療器械廠）；純水儀（南京易普易達有限公司）。

1.3 色度樣品原液準備

選取適當棕褐色液體為色度樣品原液，將其于121 ℃下高壓蒸汽滅菌20 min處理制得無菌色度樣品原液。

1.4 樣品分析

1.4.1 色度梯度

根據(jù)實際要求，將色度樣品原液按照2∶1的比例進行稀釋并得到了相應的色度梯度。本實驗設(shè)置了五個樣品色度梯度。

1.4.2 色度測定[4]

按照自然倍數(shù)稀釋法，取靜置15 min后的澄清樣品倒入50 mL具塞比色管至50 mL刻度線，量取25 mL樣品并加入25 mL水稀釋混勻備用，按照2倍稀釋方法由小到大逐級進行稀釋，每稀釋一次后按照目視比色方法觀察，直至剛好與水無法區(qū)別時停止稀釋，則得到樣品的稀釋倍數(shù)。

1.4.3 樣品接種與培養(yǎng)[1]

量取95 mL樣品色度稀釋液于無菌瓶中，加入5 mL菌液，按照比例加入培養(yǎng)基。充分搖勻溶解后，將其全部轉(zhuǎn)移至97孔定量盤中，消除氣泡并封口。將封口后的97孔定量盤放置恒溫培養(yǎng)箱，于(37±1)℃或(44.5±0.5)℃培養(yǎng)24 h。

1.4.4 質(zhì)量控制

每個樣品進行3次平行實驗，用無菌水按照1.4.3進行實驗室空白質(zhì)量控制。

1.4.5 結(jié)果分析與計算

利用標準陽性比色盤，對樣品培養(yǎng)結(jié)果進行判讀。樣品呈陽性反應，即變黃且顏色比標準陽性比色盤顏色深或相同，并記錄陽性孔數(shù)。對照97孔定量盤法MPN表，查得樣品對應的總大腸菌群和糞大腸菌群結(jié)果，如若樣品進行了稀釋，需進行相應換算。數(shù)據(jù)分析均采用統(tǒng)計分析方法，數(shù)據(jù)結(jié)果表示方式采用均值±標準差，組間數(shù)據(jù)顯著性檢驗采用t檢驗[5]。

2 結(jié)果與分析

2.1 樣品色度檢測結(jié)果

本實驗設(shè)置了5個色度梯度的樣品，每個色度樣品具體數(shù)值如表1所示。色度0樣品的色度數(shù)值為0倍，色度1樣品的色度數(shù)值為16倍，色度2樣品的色度數(shù)值為32倍，色度3樣品的色度數(shù)值為64倍，色度4樣品的色度數(shù)值為128倍。

表1 樣品色度

2.2 質(zhì)量控制結(jié)果

將無菌水按照1.4.3步驟進行接種培養(yǎng)，接種無菌水的97孔定量盤呈陰性，表明本實驗的實驗室質(zhì)量控制結(jié)果合格，本實驗檢測結(jié)果有效，符合質(zhì)控要求。

2.3 樣品色度對總大腸菌群測定的影響

為了評估樣品色度對總大腸菌群的判讀影響，本實驗按照HJ 1001—2018標準要求對5個色度樣品進行檢測分析，色度檢測的顏色變化結(jié)果如圖1所示，色度0樣品、色度1樣品、色度2樣品和色度3樣品的陽性反應可判讀，大孔數(shù)全為陽性，虛線方框表示其可判讀陽性小孔，色度4樣品的陽性反應無法判讀。在5個色度樣品接種總大腸菌群數(shù)一致的情況下，隨著樣品色度的增加，陽性反應的可判讀陽性孔數(shù)逐漸減少，最終在色度達到128倍時陽性孔數(shù)顯示無法判讀。

圖1 總大腸菌群檢測結(jié)果

另外，為了進一步測試色度對總大腸菌群檢測值的影響，本實驗將5個色度樣品的總大腸菌群的MPN值進行統(tǒng)計分析，分析結(jié)果如下圖2a所示。色度0樣品的總大腸菌群為371.2±14.1，色度1樣品的總大腸菌群為348.9±4.5，色度2樣品的總大腸菌群為240.7±3.7，色度3樣品的總大腸菌群為205.2±2.4，色度4樣品的總大腸菌群無法判讀且記為0。由此可見，隨著樣品色度的增加，樣品的總大腸菌群檢測值呈現(xiàn)變小的趨勢。

圖2 不同色度樣品的菌群檢測結(jié)果

顯著性檢驗采用t檢驗，樣品其余色度的大腸菌群數(shù)檢測值與其色度0的檢測值的統(tǒng)計分析結(jié)果顯示色度1樣品的總大腸菌群與色度0樣品的總大腸菌群相比在P＜0.01水平上無顯著性差異，其余3個樣品色度（色度2、色度3和色度4）總大腸菌群的變化與色度0樣品的總大腸菌群相比均存在較大變化，且在P＜0.01水平上差異顯著。

2.4 樣品色度對糞大腸菌群測定的影響

同樣，為了評估樣品色度對糞大腸菌群的判讀與檢測值的影響，本實驗按照HJ 1001—2018要求對5個色度樣品進行檢測分析，色度檢測的顏色變化結(jié)果如圖3所示，色度0樣品、色度1樣品和色度2樣品的陽性反應可判讀，實線方框為非陽性大孔，其余大孔為陽性大孔，虛線方框為可判讀陽性小孔，色度3樣品和色度4樣品的陽性反應無法判讀。在5個色度樣品接種糞大腸菌群數(shù)一致的情況下，隨著樣品色度的增加，陽性反應的可判讀陽性孔數(shù)逐漸減少，在色度達到64倍和128倍時陽性孔數(shù)均顯示無法判讀。另外，5個色度樣品的糞大腸菌群檢測結(jié)果如圖2b所示，色度0樣品的糞大腸菌群為126.3±7.3，色度1樣品的糞大腸菌群為109.4±8.5，色度2樣品的糞大腸菌群為85.1±9.9，色度3樣品的糞大腸菌群無法判讀且記為0，色度4樣品的糞大腸菌群無法判讀且記為0。與此同時，經(jīng)統(tǒng)計分析結(jié)果顯示色度1樣品的糞大腸菌群與色度0樣品的糞大腸菌群相比在P＜0.01水平上無顯著性差異，其余3個樣品色度（色度2、色度3和色度4）的糞大腸菌群的變化與色度0樣品的糞大腸菌群相比均存在較大變化，且在P＜0.01水平上差異顯著。

圖3 糞大腸菌群檢測結(jié)果

3 結(jié)論

本研究發(fā)現(xiàn)水質(zhì)樣品色度變化對酶底物法測定總大腸菌群和糞大腸菌群存在一定的影響，與于云江等[3]研究水質(zhì)色度干擾水質(zhì)指標測定結(jié)果一致，發(fā)現(xiàn)在總大腸菌群數(shù)和糞大腸菌群數(shù)含量不高的情況下，隨著水質(zhì)樣品色度的增加，酶底物檢測總大腸菌群和糞大腸菌群的可判讀陽性孔數(shù)會逐漸減少，總大腸菌群和糞大腸菌群的MPN檢測值也會逐漸變小。

本研究結(jié)果表明總大腸菌群在樣品色度達到128時陽性孔數(shù)無法判讀，糞大腸菌群在樣品色度達到64時陽性孔數(shù)無法判讀，說明水質(zhì)樣品色度變化會影響酶底物法陽性孔判讀，從而在一定程度上降低其測定有色水質(zhì)樣品總大腸菌群和糞大腸菌群結(jié)果的準確性和可靠性。由此可見，當水質(zhì)樣品中總大腸菌群數(shù)和糞大腸菌群數(shù)含量不高且顏色較深的情況下不宜采用酶底物法來測定二者的菌群數(shù)。

綜上所述，本研究關(guān)于評估水質(zhì)樣品色度變化對酶底物法測定總大腸菌群數(shù)和糞大腸菌群的影響得到的結(jié)論，為準確檢測水質(zhì)樣品中總大腸菌群數(shù)和糞大腸菌群數(shù)提供一定的科學依據(jù)。