不同檢測方法對中國豬場仔豬球蟲感染情況的對比調查

張擇揚　張軍　趙永旭

摘? 要：豬囊等孢球蟲（cystoisospora suis）是一種重要的原生動物寄生蟲，可導致幼齡仔豬嚴重腹瀉。對用飽和食鹽或尿素溶液處理后的糞便進行顯微鏡卵囊計數，是鑒定仔豬球蟲病感染程度的常用方法。然而，作為一種新型的檢測方法，基于分子生物學技術對球蟲基因進行熒光定量PCR檢測，已經被歐美國家廣泛應用。相比于傳統的漂浮顯微鏡檢法，該方法具有更高的敏感性和特異性，可以幫助豬場及早發現隱性感染豬，在臨床癥狀出現前進行干預，減少經濟損失。本文展示了2022—2023年期間，分別使用熒光定量PCR和漂浮顯微鏡檢法對中國不同地區的? 23家豬場的仔豬球蟲感染情況進行流行病學調查的結果。

關鍵詞：仔豬球蟲病，檢測方法，流行病學調查

中圖分類號：S855.9+1 文獻標志碼：A? ? ? ? ? ? 文章編號：1000769（2023）05-0105-04

養豬生產在本質上是一種生產投資行為，如何保證有效的投資回報率，是養豬生產者應始終關心的問題。從養豬成本占比來看，60％以上的成本來源于飼料投入[1]。被豬采食的飼料要想成為養豬生產者的收入來源——豬肉，都要通過豬腸道這個“加工廠”進行轉化。因此，豬腸道的健康直接關乎豬場的經濟效益和投資回報率。豬腸道一旦出現問題，輕則營養物質流失，導致飼料浪費；重則機體脫水消瘦，危及生命。剛出生的仔豬抵抗力較弱，該階段危害其腸道健康的重要“兇手”之一就是豬囊等孢球蟲。

1? 病原及危害

導致初生仔豬發病的球蟲只有一種：豬囊等孢球蟲，其卵囊的形狀猶如“雙黃蛋”（圖1），雙層外殼中包含兩個孢子囊，通過這一形態學特征可以與其他種類的球蟲進行區分。豬囊等孢球蟲主要感染1～7日齡哺乳仔豬，感染豬的年齡越小，引發的臨床癥狀和經濟損失就越嚴重。而對于年齡更大的豬，如保育豬、育肥豬及后備母豬等，豬囊等孢球蟲的感染力不強。當仔豬攝入有感染力的蟲卵后，一般要經歷5 d左右的潛伏期，此階段寄生蟲體在仔豬腸道的上皮細胞中生長、繁殖，導致腸道上皮細胞受損、脫落[2]。此時母乳中的蛋白質、脂肪等營養物質將無法被仔豬的腸道吸收，導致仔豬出現腹瀉癥狀。有研究表明，球蟲感染導致仔豬斷奶體重減少1 kg，達到95 kg屠宰體重所需的時間增加9 d，經濟損失約100元/頭[3]。

2? 材料和方法

2.1 檢測樣本

根據豬場的規模大小，選擇5～20窩的哺乳仔豬。使用一次性聚乙烯或乳膠手套，收集產床上仔豬的糞便于采樣管中，每窩一管，混樣約10 g，做好標記，其內容包括：窩編號、采樣日期、仔豬日齡。采完一窩更換一組手套（圖2）。

本試驗是為檢測仔豬糞便樣本中的球蟲卵囊。但是，仔豬只有在感染后的第5～7天和第12天才會出現兩次排卵囊高峰，因此錯誤的采樣時段會導致檢測結果的假陰性。為避免漏檢的情況，本試驗對7～14日齡仔豬進行第1次采樣，間隔7 d后進行第2次采樣（圖3）。將第1次采樣的糞便樣本放置于2～8 ℃冰箱中保存，待完成第2次的樣本采集后和第? 1次采集的樣本按窩標號混合送檢，全程冷鏈運輸。

2.2 檢測方法

從23家豬場中共采集到261份仔豬糞便樣本，將每份樣本一分為二，其中一份送往某高校檢測實驗室，由該實驗室使用漂浮顯微鏡檢法進行檢測；另一份送詩華杭州科學支持與診斷實驗室，使用熒光定量PCR法進行檢測。

2.3 漂浮顯微鏡檢法

2.3.1 樣本處理

將仔豬糞便樣本加入到一個容器中，加入足夠的飽和食鹽水。

2.3.2 攪拌和過濾

將樣本和鹽水混合均勻，然后用過濾器對樣本進行過濾，去除大顆粒物質。

2.3.3 漂浮

將過濾后的樣本轉移到漂浮器中，隨后加入足夠的飽和食鹽水，使樣本在鹽水中漂浮。

2.3.4 觀察和檢測

用顯微鏡觀察漂浮在鹽水表面的顆粒，檢測是否存在球蟲卵或幼蟲。

2.4 熒光定量PCR法

2.4.1 樣本收集

從疑似感染球蟲的仔豬糞便樣本中收集適量的樣本。

2.4.2 DNA提取

使用商業化的Power Fecal DNA （QIAGEN的試劑盒，從糞便樣本中提取球蟲的DNA。

2.4.3 PCR反應體系準備

準備PCR反應混合液，包括使用球蟲線粒體和核糖體內轉錄間隔區（internal transcribed space，ITS）基因設計的引物、DNA模板、聚合酶和缺失核苷酸。

2.4.4 PCR反應

將PCR反應混合液置于PCR儀QuantStudio 3??（Thermo Scientific）中，進行一系列的溫度循環，包括DNA變性、引物結合和DNA擴增等步驟。

數據讀取，根據電腦推送結果，得出試驗數據。

3? 結果與討論

檢測結果顯示，采用漂浮顯微鏡檢法，豬場陽性率為22％，仔豬糞便樣本陽性率為3％；采用熒光定量PCR法，豬場陽性率為78％；仔豬糞便樣本陽性率為41％（表1）；并且漂浮顯微鏡檢法結果為陽性的樣本，熒光定量PCR法也為陽性（表2）。

通過對比兩種方法的檢測結果，發現熒光定量PCR法在仔豬球蟲感染檢測中具有明顯的優勢。首先，在敏感性方面，熒光定量PCR法是檢測糞便中的球蟲DNA，其球蟲卵囊需求數量比傳統漂浮顯微鏡檢法的少，因此結果更加敏感。這使得豬場能夠及早發現隱性感染豬，即使在臨床癥狀出現之前，也能進行干預，從而減少經濟損失。其次，熒光定量PCR法具有更高的特異性。傳統的漂浮顯微鏡檢法在卵囊計數過程中存在一定的主觀性，容易受檢測人員的經驗和技術水平的影響。而熒光定量PCR法通過特定引物和探針的選擇，可以更準確地識別仔豬球蟲的DNA序列，避免了誤判和漏診的情況。第三，熒光定量PCR法還具有更快的檢測速度和更高的自動化程度，可以通過自動化設備進行高通量的樣本檢測，最多一次可以檢測96個樣本，大大提高了檢測效率。

根據吉林農業大學宮慶龍等[4]通過檢索1980—2019年的文獻顯示，豬囊等孢球蟲在中國豬場中的流行率為9.1％。楊光友等[5]對四川省豬場調查后發現，豬囊等孢球蟲的流行率為18.7％。這些結果均低于本試驗中使用熒光定量PCR法獲得的42％的流行率。該結果提示，我國豬場球蟲的感染率可能顯著高于之前的統計數據，傳統的漂浮顯微鏡檢法檢測由于敏感性較低，導致隱性感染較多，豬場不能及早發現問題。

4? 結論

綜上所述，本研究結果表明，熒光定量PCR法在中國豬場仔豬球蟲病檢測中具有明顯的優勢。它不僅在發現隱性感染豬方面更敏感，還具有更高的特異性、更快的檢測速度和更高的自動化程度。因此，在豬場管理中推廣熒光定量PCR法作為仔豬球蟲病的主要檢測方法，以提高疾病的早期檢測和控制效果，減少經濟損失。

5? 挑戰與展望

本研究僅在中國不同地區的23家豬場進行了流行病學調查，因此結果可能受到地區和糞便樣本數的限制。未來的研究可以擴大樣本規模，以進一步驗證本研究的結論。此外，還可以探索其他新型檢測方法，以提高仔豬球蟲病的檢測效果和管理水平。

參考文獻

[1] CANDIDO POMAR，INES ANDRETTA，ALINE REMUS. Feeding strategies to reduce nutrient losses and improve the sustainability of growing pigs[J]．Frontiers in Veterinary Science，2021，8：42220.

[2] SAMARASINGHE B，JOHNSON J，RYAN U.Phylogenetic analysis of Cystoisospora species at the rRNA ITS1 locus and development of a PCR-RFLP assay[J]．Experimental Parasitology，2008，118（4）：592-595.

[3] National Animal Disease Information Service， Disease A-Z， Coccidiosis in Piglets. https：//nadis.org.uk/disease-a-z/pigs/coccidiosis-in-piglets/ NADIS - National Animal Disease Information Service

[4] GONG Q L，ZHAO W X，WANG Y C，et al．Prevalence of coccidia in domestic pigs in China between 1980 and 2019： a systematic review and meta-analysis[J]．2021，14（1）：248.

[5] 楊光友，曾智勇，郭莉，等．四川省仔豬球蟲病的流行病學調查[J]．中國獸醫科技，2004，34（3）：31-34.