雌二醇和黃體酮對豬精液冷凍保存效果的影響

姜煒彥　張碧掎

摘? 要：人工授精技術的發展使優良種公畜的基因得以延續，在畜禽養殖中占有越來越重要的地位，而精液的保存技術也相得益彰。本試驗通過在基礎稀釋液中分別添加不同濃度的雌二醇和黃體酮，初步研究了生殖激素對豬精液冷凍保存效果的影響。結果顯示，雌二醇、黃體酮對豬精液冷凍保存后精子活率和活力的維持均有一定效果，最適濃度分別為10、200 ?g/mL，但在細胞膜完整性方面沒有突出效果。

關鍵詞：豬精液；冷凍保存；雌二醇；黃體酮

中圖分類號：S828 文獻標志碼：A 文章編號：1001-0769（2023）05-0030-04

生殖激素在豬的繁殖中起著重要作用。精液中的激素水平對雄性動物的精子生成能力、精液品質好壞、精子的受精能力以及抗凍能力等有重要的影響，其中有緊密聯系的是生殖激素[1]。此外，在精液穿越雌性動物生殖道的過程中，雌激素可能與精子相互作用，如生精上皮缺乏雌激素可導致精子細胞分化產生障礙[2]，從而影響精子的運動、獲能、受精的各項功能。其中黃體酮對子宮內膜有著顯著的形態學影響，是一種維持妊娠的必需激素[3]。而雌二醇對精子的激活有著舉足輕重的作用，可以通過升高精子胞漿內的Ca2+濃度維持精子的功能[4]。朱首倫[5]通過研究黃體酮注射液對人類精子的作用效果，發現精子膜上存在著一個孕酮門，可以激起Ca2+內流，從而增強精子的活力。生殖激素在精液體外保存中扮演著至關重要的角色，給精液冷凍保存技術的研究帶來了新的突破點。本試驗通過運用雌二醇和黃體酮這兩種生殖激素，研究其在豬精液冷凍保存中產生的影響效果。

1? 材料與方法

1.1? 材料

1.1.1 精液來源

新鮮公豬精液由湛江市遂溪縣建新鎮高豐種豬場提供，約一周對種公豬采精一次，用于試驗的精子活力不低于70％。

1.1.2 主要試劑與藥物

葡萄糖、一水合檸檬酸、二水合檸檬酸三鈉、丙三醇購自廣東光華科技股份有限公司，果糖購自上海圻明生物科技有限公司，硫酸阿米卡星購自齊魯制藥有限公司，苯甲酸雌二醇、黃體酮購自寧波第二激素廠，三羥甲基氨基甲烷購自國藥集團化學試劑有限公司，氨基-鈉-十二烷硫酸酯購自日本，卵黃取自于雞蛋，液氮購自湛江市制氧廠。

1.1.3 主要儀器

電熱恒溫水浴鍋購自上海科恒實業發展有限公司，數顯恒溫電熱板購自常州市金壇區白塔新寶儀器廠，電子分析天平購自常熟市雙杰測試儀器廠，Nanopure Life Science超純水器購自賽默飛世爾科技有限公司，立式壓力蒸汽滅菌鍋購自上海博迅有限公司，雙目生物顯微鏡購自南京江南永新光學有限公司，數顯鼓風干燥箱購自上海博迅實業有限公司醫療設備廠，臺式高速離心機購自湖南赫西儀器裝備有限公司，離心管（1.5、15、50 mL）、一次性移液槍槍頭、移液槍（5、10、50、200、? ? 1 000 ?L均購自北京諾博萊德科技有限公司，濾紙，蛋清分離器，冰箱。

1.2? 方法

1.2.1 精液采集

本試驗以手握法對種公豬進行采精操作。為防止溫差過大造成精子死亡，在精液采集前35～37 ℃預熱采精杯，采精杯上覆蓋濾紙，濾紙微孔約100 ?m，精子可通過并可濾去精液中的膠體物質。采精時只收集中間濃厚乳白色的精液，棄去前面較稀的精清，以四層以上的紗布過濾掉膠粒物質，但應防止紗布中的棉屑脫落，以免破壞精液品質[6]。檢查前需將精液放在? ?37 ℃水浴鍋中預熱。精液的品質檢查包括外觀、氣味、活力三方面。然后用基礎稀釋液將精液稀釋至所需濃度，分裝于冰箱保存備用。

1.2.2 稀釋液配制

稀釋液Ⅰ的配制：精確稱取0.4 g葡萄糖、1.59 g一水合檸檬酸、2.9 g三羥甲基氨基甲烷于燒杯中，加入200 ?L硫酸阿米卡星，然后加入20 mL超純水進行溶解。將卵黃與蛋清分離，用濾紙將卵黃上的蛋清吸干后，用移液槍吸取卵黃加入溶液中，其比例為基礎稀釋液配方的20％，最后用超純水定容至? ? ? ?100 mL，輕輕混勻，避免產生過多泡沫。分裝后，3 000 r/min離心20 min，留上層清液，5 ℃密封保存。

稀釋液Ⅱ的配制：取47 mL稀釋液Ⅰ，加入3 mL丙三醇和0.3％的氨基-鈉-十二烷硫酸酯，充分搖勻后，5 ℃密封保存。

1.2.3 試驗設計與精液保存

試驗共分三個組，分別為雌二醇組、黃體酮組和空白對照組，其中雌二醇組和黃體組各設三個重復。雌二醇組三個重復所用的稀釋液Ⅰ中分別添加5、10、20 μg/mL的雌二醇，黃體酮組三個重復所用的稀釋Ⅰ中分別加入50、100、200 μg/mL的黃體酮，空白對照組所用稀釋液中不添加任何生殖激素。

將稀釋液Ⅰ于30 ℃水浴鍋中預熱。將合格精液分裝于離心管，2 000 r/min離心10 min，棄去上清液，將下層精子集裝在廣口瓶中，用血球計數板測定精子濃度。用稀釋液Ⅰ將精子稀釋到2×108個/mL左右，做好標簽（命名為稀釋液Ⅰ-Ⅰ），封口，5 ℃保存。15 min后將稀釋液Ⅰ-Ⅰ與稀釋液Ⅱ以1∶1混合，5 ℃放置2 h，分裝入精液細管。準備一個裝有液氮的泡沫箱，上漂浮一個泡沫板，將裝有精液的精液細管置于泡沫板上約15 min后放入液氮，待凍后，迅速放入液氮罐中保存。

1.2.4 精液品質檢測

精子活率

精子活率是指精液中活精子的比例，若精子活率低下，則無需進行試驗。活率的檢測可使用目測法，即觀察3個視野內活精子數占總精子數的百分比，取平均值。

精子活力

精子活力是檢測精液品質的重要指標之一。精子的運動狀況一般分為5種：①快速直線運動，活力為100％，標記為“+++”；? ②較為緩慢直線運動，活力為75％，標記為“++”；③緩慢運動，活力為50％，標記為“+”；④原地轉圈運動，活力為25％，標記為“±”；⑤基本不動或精子死亡，活力為0，標記為“-”。精子對溫度十分敏感，檢查精子活力時，需要將精液細管同裝有液氮的廣口瓶一同從液氮罐中取出，放進裝有液氮的泡沫箱中，以免造成溫差過大影響后續的試驗結果。將精液細管放入39.5 ℃的恒溫水浴鍋中預熱3 s，取出，用剪刀先將下端剪開，再剪開上端，使細管中的精液流入水浴鍋中漂浮板上的1 mL離心管，備用觀察。載破片和蓋破片預熱至39.5 ℃。吸取10 ?L待檢精液在載玻片上，蓋上蓋玻片，顯微鏡下觀察精子活力，約觀察3個視野內的精子活力，記錄數據，結果取平均值。

精子細胞膜完整性

檢測精子細胞膜完整性常見的方法有常規染色法、熒光染色法以及低滲腫脹試驗[7]。其中低滲腫脹試驗因成本低廉、操作簡單，廣為應用。該方法可直觀反映精子細胞膜的功能狀態[8]。

配制HOST低滲溶液。將裝在1 mL離心管中的精液2 000 r/min離心5 min，去上清液，加入90 ?L的HOST低滲溶液，反復吹吸均勻，靜置10 min，取10 ?L待檢液于顯微鏡下觀察。隨機檢測3～5個視野內精子尾部腫脹情況，尾部卷曲表示細胞膜完整，視野內精子數必須超過200個，記錄數據，取平均值。

2? 試驗結果

2.1 雌二醇對豬精液冷凍保存效果的影響

表1顯示，稀釋液中添加不同濃度的雌二醇對豬精液冷凍保存后的精子活率和活力的維持均有有益的影響，與對照組精液相比差異顯著（P＜0.05），其中雌二醇的最適濃度是? 10 ?g/mL。但是雌二醇對豬精子細胞膜完整性的保護效果不顯著（P＞0.05）。

2.2 黃體酮對豬精液冷凍保存效果的影響

表2顯示，稀釋液中添加不同濃度的黃體酮對豬精液冷凍保存后的精子活率和活力的維持均有有益的影響，與對照組精液相比差異顯著（P＜0.05），其中黃體酮的最適濃度是 200 ?g/mL。但是黃體酮對豬精子細胞膜完整性的保護效果不顯著（P＞0.05）。

2.3 兩種激素對豬精液冷凍保存效果的對比

由圖1可知，稀釋液中添加10 ?g/mL雌二醇或200 ?g/mL黃體酮均有利于維持豬精液冷凍保存后的精子活率，與對照組精液相比差異顯著（P＜0.05），但兩種激素對精液冷凍后精子活力的保存效果差異不顯著。

由圖2可知，稀釋液中添加10 ?g/mL雌二醇或200 ?g/mL黃體酮均有利于維持豬精液冷凍保存的精子活力，與對照組精液相比差異顯著（P＜0.05），但兩種激素對精液冷凍后精子活力的保存效果差異不顯著。

3? 討論

3.1 雌二醇保存效果的分析

精子在凍融過程中會形成冰晶，受到一定的損害，導致精子的超微結構改變和新陳代謝紊亂。而雌激素可以增加精子細胞膜和線粒體膜的穩定性，促進精子細胞的分裂、增殖以及分化，減少細胞凋亡。研究證明，稀釋液中添加一定濃度的雌二醇可減少冷凍保存中精子細胞凋亡，延長精子存活時間，提高其運動能力和卵膜穿透力，使精子活力增強，對凍融后精子的各項功能恢復有有益作用。雌二醇還能作用于精子膜上的雌激素受體，提高精子內Ca2+的濃度，激活腺苷酸環化酶信號通路。在本試驗中，稀釋液中加入雌二醇可明顯降低冷凍保存對精子質量的損傷，證明雌二醇對凍融后精子激活、保護和功能的恢復有利。

3.2 黃體酮保存效果的分析

黃體酮是一種由卵巢黃體分泌的天然孕激素，能促進精子獲能和誘導頂體反應。有研究表明，精子膜上存在著一個由孕酮門控制的Ca2+通道，添加黃體酮能刺激Ca2+內流，使精子內Ca2+濃度增加。Ca2+作為細胞內第二信使，在精子各生理過程中起著關鍵作用，可以增強精子運動。精子尾部最敏感，凍融會導致鞭毛的軸絲結構受到損傷，從而影響精子活力。精子尾部的Ca2+通道發揮著關鍵作用。Ca2+可以調節精子鞭毛運動。鞭毛中的Ca2+可以影響動力蛋白臂的滑動，使鞭毛不斷地進行擺動運動。因此，黃體酮有助于精子凍融后功能的恢復。

4? 結論

綜上所述，稀釋液中加入一定濃度的雌二醇或黃體酮對對冷凍保存精液中的精子具有一定的保護效果，有益于豬精液凍融后精子活率和活力的維持，但對豬精子細胞膜完整性的保護效果不顯著。雌二醇和黃體酮的最適濃度分別為10 ?g/mL和200 ?g/mL，這為臨床上通過運用生殖激素改善精子質量來提高人工授精率提供了一定的試驗依據。

參考文獻

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