彝族高血壓患者代謝產(chǎn)物分析及相關(guān)機(jī)制研究*

李文俊,姬燕梅,楊云紅,田海濤,孫 嫄,周 丹,李吉?jiǎng)?郭 妮,蒙 妮,金醒昉

(昆明醫(yī)科大學(xué)附屬延安醫(yī)院心臟大血管外科,昆明 650051)

高血壓是基因、環(huán)境、民族、代謝等多種因素共同作用的結(jié)果,而代謝異常在高血壓發(fā)生、發(fā)展中的作用和機(jī)制尚不明確。代謝產(chǎn)物可跳過(guò)復(fù)雜的調(diào)控過(guò)程直接反映出最終的代謝變化,在多種疾病的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮重要作用。代謝組學(xué)是分析代謝產(chǎn)物種類、數(shù)量動(dòng)態(tài)改變及其規(guī)律的科學(xué),從相對(duì)簡(jiǎn)單的微生物到植物、哺乳動(dòng)物等復(fù)雜的多生物體系,各種各樣的生物系統(tǒng)都受益于代謝組學(xué)研究[1]。通過(guò)代謝組學(xué)可檢測(cè)到生物學(xué)途徑中的微妙改變,以深入了解各種生理?xiàng)l件和疾病的機(jī)制[2]。云南是少數(shù)民族聚居地之一,高血壓發(fā)病率較高。本研究通過(guò)對(duì)云南彝族高血壓患者和對(duì)照組血清代謝產(chǎn)物進(jìn)行分析,探索代謝產(chǎn)物與云南彝族高血壓發(fā)生、發(fā)展的關(guān)系,為其機(jī)制研究提供新思路和新靶點(diǎn)。

1 資料與方法

1.1 一般資料

2018年11月至2020年10月課題組于流行病學(xué)調(diào)查中選取彝族原發(fā)性高血壓患者20例(高血壓組)與健康者10例(對(duì)照組)作為研究對(duì)象。納入標(biāo)準(zhǔn):(1)年齡≥40歲;(2)非長(zhǎng)期臥床;(3)云南彝族地區(qū)居住年限超過(guò)3年;(4)具備基本溝通能力;(5)自愿加入此項(xiàng)研究,并簽署知情同意書;(6)符合高血壓診斷標(biāo)準(zhǔn);(7)無(wú)心、腦、腎、肺或其他任何主要人體器官實(shí)質(zhì)性改變。排除標(biāo)準(zhǔn):(1)短期內(nèi)人體組分急性改變,如嚴(yán)重的脫水、水腫、發(fā)熱或感染等;(2)患有精神疾病;(3)患有重要器官功能衰竭(如急性心力衰竭、腎功能衰竭、呼吸衰竭等);(4)已知患有冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟病、糖尿病、腦血管疾病、癡呆、呼吸系統(tǒng)疾病(慢性阻塞性肺疾病、哮喘等);(5)不愿意參與本研究。

1.2 方法

1.2.1相關(guān)檢查

受試者均經(jīng)過(guò)病史詢問(wèn)、體格檢查及實(shí)驗(yàn)室輔助檢查。(1)一般情況:包括身高、體重、腰圍(waist circumference,WC)、臀圍(hip circumference,HC)、收縮壓、舒張壓、心率等。(2)實(shí)驗(yàn)室指標(biāo):空腹血糖(glucose,GLU)、血脂[包括總膽固醇(total cholesterol,TC)、甘油三酯(triglyceride,TG)、低密度脂蛋白膽固醇(low density lipoprotein cholesterol,LDL-C)、高密度脂蛋白膽固醇(high density lipoprotein cholesterol,HDL-C)]、甲狀腺功能、血常規(guī)等。(3)問(wèn)卷調(diào)查:采用現(xiàn)場(chǎng)集中、面對(duì)面詢問(wèn),每位受試者由1～2名調(diào)查人員進(jìn)行問(wèn)卷調(diào)查,受試者不能理解的客觀問(wèn)題,允許由其陪伴或翻譯人員代答,對(duì)主觀問(wèn)題及部分涉及必須回答的問(wèn)題,由受試者親自回答,翻譯人員進(jìn)行翻譯。

1.2.2試劑及儀器

主要試劑:甲醇、乙腈、乙酸銨、氨水。實(shí)驗(yàn)儀器:Vanquish超高效液相(美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司),Q Exactive HFX高分辨質(zhì)譜(美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司),Heraeus Fresco17離心機(jī)(美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司),天平(德國(guó)Sartorius公司),明澈純水儀(美國(guó)Millipore公司),超聲儀(深圳市雷德邦電子有限公司)。

1.2.3樣本制備

靜息狀態(tài)下抽取患者肘前靜脈血3 mL置于肝素抗凝管中,立即于4 ℃冰箱內(nèi)保存。采血后2 h內(nèi)于室溫下3 000 r/min離心10 min,取上層血清100 μL(其余于-80 ℃冰箱凍存)。

1.2.4儀器分析與數(shù)據(jù)處理

1.2.4.1代謝物提取

移取100 μL樣品至EP管中,加入400 μL提取液[甲醇∶乙腈=1∶1(V/V),含同位素標(biāo)記內(nèi)標(biāo)混合物],渦旋混勻30 s;超聲10 min(冰水浴);-40 ℃靜置1 h;將樣品于4 ℃、12 000 r/min離心15 min;取上清液于進(jìn)樣瓶中上機(jī)檢測(cè);所有樣品另取等量上清液混合成質(zhì)量控制樣品上機(jī)檢測(cè)。

1.2.4.2上機(jī)檢測(cè)

采用Waters ACQUITY UPLC BEH Amide(2.1 mm×100.0 mm,1.7 μm)液相色譜柱對(duì)目標(biāo)化合物進(jìn)行色譜分離。液相色譜A相為水相,含25 mmol/L乙酸銨和25 mmol/L氨水,B相為乙腈。采用梯度洗脫:0～<0.5 min,95%B;0.5～7.0 min,95%B→65%B;7.0～8.0 min,65%B→40%B;8.0～9.0 min,40%B;9.0～9.1 min,40%B→95%B;9.1～12.0 min,95%B。流動(dòng)相流速:0.5 mL/min,柱溫25 ℃,樣品盤溫度4 ℃,進(jìn)樣體積3 μL。

1.2.4.3數(shù)據(jù)處理

原始數(shù)據(jù)經(jīng)ProteoWizard軟件轉(zhuǎn)成mzXML格式后,使用自主編寫的R程序包(內(nèi)核為XCMS)進(jìn)行峰識(shí)別、峰提取、峰對(duì)齊和積分等處理,然后與BiotreeDB(V2.1)自建二級(jí)質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫(kù)匹配進(jìn)行物質(zhì)注釋,算法打分的Cut-off值設(shè)為0.3。采用有監(jiān)督的偏最小二乘判別分析(partial least squares discriminant analysis,PLS-DA)進(jìn)行模式識(shí)別。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 兩組臨床資料比較

兩組的年齡、性別、WC、HC、TC、TG、LDL-C、HDL-C、收縮壓、舒張壓、GLU、促甲狀腺素(thyroid stimulating hormone,TSH)比較,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05);高血壓組收縮壓、舒張壓高于對(duì)照組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)),見(jiàn)表1。

表1 兩組臨床資料比較

2.2 兩組主成分分析

采用有監(jiān)督的PLS-DA進(jìn)行模式識(shí)別發(fā)現(xiàn)在正、負(fù)離子下兩組血清樣品分離較好,其模型的擬合能力和預(yù)測(cè)能力指數(shù)分別為:正離子在Y軸方向模型的累積解釋率(R2Y)=0.900,模型的累積預(yù)測(cè)率(Q2)=0.390;負(fù)離子R2Y=0.933,Q2=0.373,見(jiàn)圖1。模型驗(yàn)證結(jié)果顯示,正交偏最小二乘判別分析(Orthogonal PLS-DA,OPLS-DA)模型具有較高的可靠性。

A:所有樣品血清代謝產(chǎn)物的正離子OPLS-DA評(píng)分圖;B:所有樣品血清代謝產(chǎn)物的負(fù)離子 OPLS-DA評(píng)分圖。圖1 兩組血清代謝組的非靶向代謝組學(xué)

2.3 高血壓代謝標(biāo)志物篩選

共檢測(cè)出代謝物8 470種,其中正離子5 055種,二級(jí)質(zhì)譜定性匹配分析得到物質(zhì)名稱的有421種;負(fù)離子3 415種,二級(jí)質(zhì)譜定性匹配分析得到物質(zhì)名稱的有190種。以變量投影重要性(variable importance in projection,VIP)>1,P<0.05作為篩選條件,共發(fā)現(xiàn)80個(gè)差異代謝產(chǎn)物,其中負(fù)離子模式下有38個(gè)差異代謝物,正離子模式下體驗(yàn)42個(gè)差異代謝物;以VIP>1,P<0.05、差異倍數(shù)(fold change,FC)>2或<0.5作為篩選條件,共發(fā)現(xiàn)4個(gè)差異代謝產(chǎn)物(潛在的生物標(biāo)志物),其中負(fù)離子模式下有3個(gè)差異代謝物,正離子模式下有1個(gè)差異代謝物,分別為鄰苯二酚(Pyrocatechol)、馬尿酸(Hippuric acid)、N-乙酰芳胺(N-Acetylarylamine)、辛弗林丙酮(Synephrine acetonide),見(jiàn)表2、3。

表2 正離子差異代謝物

表3 負(fù)離子差異代謝物

2.4 代謝通路分析

以代謝反應(yīng)為線索,串聯(lián)可能的代謝途徑及對(duì)應(yīng)的調(diào)控蛋白,整理出對(duì)應(yīng)人類(Homo sapiens)差異代謝物映射的通路共有51條,通過(guò)氣泡圖,篩選出4條影響最大的代謝通路分別為甘油磷脂代謝,鞘脂代謝,苯丙氨酸代謝,丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代謝,見(jiàn)圖2。

A:正離子通路富集分析圖;B:負(fù)離子通路富集分析圖;橫坐標(biāo)位置和氣泡大小代表路徑影響;縱坐標(biāo)位置和氣泡顏色代表豐富程度。圖2 正負(fù)離子通路富集分析圖

將差異代謝產(chǎn)物與已知代謝途徑庫(kù)(KEGG)進(jìn)行生物信息還原,篩選出差異代謝通路包括:正離子的鞘脂代謝、甘油磷脂代謝、醚脂代謝、組氨酸代謝、半胱氨酸和L-甲硫氨酸代謝、嘧啶代謝、色氨酸代謝;負(fù)離子的苯丙氨酸代謝,丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代謝,D-谷氨酰胺和D-谷氨酸代謝,丁酸代謝,抗壞血酸和醛糖代謝,牛磺酸和亞牛磺酸代謝,檸檬酸循環(huán)(TCA循環(huán)),糖酵解或糖異生、戊糖磷酸途徑,維生素B6代謝,丙酮酸代謝,磷酸肌醇代謝通路。

3 討 論

代謝產(chǎn)物可跳過(guò)復(fù)雜的調(diào)控過(guò)程直接反映最終的代謝變化,代謝產(chǎn)物在包括高血壓在內(nèi)的多種疾病發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮重要作用。通過(guò)代謝組學(xué)檢測(cè)到生物學(xué)途徑中的微妙改變,可以深入了解各種生理?xiàng)l件和疾病機(jī)制[2]。

有學(xué)者采用代謝組學(xué)研究聯(lián)盟的隊(duì)列數(shù)據(jù)研究血液代謝物與高血壓的關(guān)聯(lián),發(fā)現(xiàn)在調(diào)整性別、年齡、BMI、種族和多項(xiàng)指標(biāo)后,在12 479例高血壓患者和31 827例無(wú)腎功能損傷的對(duì)照人群中發(fā)現(xiàn)了38種與高血壓相關(guān)的代謝物,該研究為迄今為止最大的橫斷面高血壓代謝組學(xué)研究[3]。通路分析進(jìn)一步表明,氨基酸、絲氨酸/甘氨酸和膽汁酸在高血壓調(diào)節(jié)中發(fā)揮作用,確定了32種循環(huán)代謝物是潛在的干預(yù)靶點(diǎn),但仍需要進(jìn)一步進(jìn)行體內(nèi)試驗(yàn)來(lái)確定其在高血壓病因或進(jìn)展中的具體作用。本研究結(jié)果顯示,本院彝族高血壓組與對(duì)照組比較中,最明顯的差異代謝產(chǎn)物為鄰苯二酚、馬尿酸、N-乙酰芳胺、辛弗林丙酮。而有研究顯示,在服用美托洛爾的患者尿液中,許多腸道微生物群依賴性代謝物(包括羥基馬尿酸、馬尿酸和甲基尿酸)水平明顯升高[4];在慢性腎臟病大鼠模型中,發(fā)現(xiàn)血漿犬尿酸和馬尿酸水平明顯升高[5]。代謝組學(xué)分析確定了多種與慢性腎臟病病因密切相關(guān)的代謝物,包含16-羥基棕櫚酸酯、犬尿酸酯、高香草酸鹽硫酸鹽、馬尿酸鹽、高瓜氨酸和1,5-脫水葡糖醇[6]。另有研究表明,殘余腎功能與馬尿酸血漿水平呈負(fù)相關(guān),較高的殘余腎肌酐清除率與較低的犬尿酸、硫酸吲哚醇、吲哚-3-乙酸、對(duì)甲酚葡糖苷酸和馬尿酸血漿水平有關(guān)[7]。血管緊張素轉(zhuǎn)換酶在調(diào)節(jié)人體血壓方面起重要作用,在血管緊張素轉(zhuǎn)換酶的作用下,馬尿酰-組二酰-亮氨酸作為底物可轉(zhuǎn)化為馬尿酸[8],故考慮馬尿酸與腎臟功能相關(guān),從而影響血壓。

同時(shí),本研究中云南彝族高血壓患者與對(duì)照人群差異代謝通路包含鞘脂代謝、甘油磷脂代謝、氨基酸代謝(色氨酸代謝,苯丙氨酸代謝,丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代謝)、脂肪酸代謝(丁酸代謝)、能量代謝(糖酵解、磷酸戊糖途徑)等。有學(xué)者通過(guò)非靶向代謝組學(xué)鑒定出原發(fā)性高血壓患者尿液中包括L-甲硫氨酸等10種潛在生物標(biāo)志物,涉及的代謝途徑包括氨基酸代謝、脂肪酸代謝、類固醇激素、生物合成和氧化應(yīng)激[9],這與本研究結(jié)果一致。體內(nèi)研究支持鞘脂在高血壓病理生理學(xué)中的作用,例如自發(fā)性高血壓大鼠顯示總神經(jīng)酰胺和鞘氨醇血漿水平升高[10]。內(nèi)皮細(xì)胞功能與鞘脂代謝密切相關(guān),正常的鞘脂代謝對(duì)于維持內(nèi)皮細(xì)胞穩(wěn)態(tài)至關(guān)重要,異常情況下的鞘脂代謝物或關(guān)鍵酶(包括鞘氨醇、神經(jīng)酰胺、1-磷酸鞘氨醇等)可能對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞的功能有保護(hù)或破壞作用[11]。越來(lái)越多的實(shí)驗(yàn)和臨床研究強(qiáng)調(diào)了鞘脂在心血管疾病,尤其是缺血性心臟病、高血壓、心力衰竭和卒中等疾病中的病理生理學(xué)關(guān)鍵作用[12]。神經(jīng)酰胺水平增加與不良心血管風(fēng)險(xiǎn)和事件密切相關(guān),抑制神經(jīng)酰胺的合成或加速其降解可改善多種心血管疾病[13]。粗糧攝入與血壓之間的負(fù)相關(guān)可能是由鞘脂代謝物介導(dǎo)[14]。鞘脂是脂質(zhì)的不同種類,也是細(xì)胞膜中的結(jié)構(gòu)分子和信號(hào)分子,參與關(guān)鍵細(xì)胞功能的調(diào)節(jié),在維持體內(nèi)穩(wěn)態(tài)方面具有關(guān)鍵作用,已被用作預(yù)測(cè)人群疾病的潛在生物標(biāo)記[15]。

有研究顯示,高血壓患者和健康人群間血清代謝物存在差異,其主要參與脂肪酸代謝,甘油磷脂代謝,丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代謝,與胰島素抵抗、血管重塑、巨噬細(xì)胞等相關(guān)[16]。而高鹽飲食誘導(dǎo)富馬酸、L-乳酸、肌酐、L-丙氨酸、甘氨酸和L-半胱氨酸水平明顯升高,與糖酵解相關(guān)的氨基酸代謝通路明顯改變[17]。在人類和動(dòng)物代謝組學(xué)研究中,確定了數(shù)種共同的代謝通路,包括丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代謝、氨酰-tRNA生物合成和精氨酸生物合成,其與胰島素抵抗、炎癥狀態(tài)和一氧化氮產(chǎn)生受損等密切相關(guān)的代謝標(biāo)志物和通路有助于原發(fā)性高血壓的發(fā)展,可為早期診斷或預(yù)測(cè)提供依據(jù)[18]。研究發(fā)現(xiàn),補(bǔ)充L-苯丙氨酸可通過(guò)改善血管功能和腎功能來(lái)減輕鹽敏感性高血壓大鼠的鹽誘導(dǎo)高血壓[19]。隱匿性高血壓患者中亮氨酸/異亮氨酸、纈氨酸、L-甲硫氨酸、苯丙氨酸等氨基酸水平高于健康人群;隱匿性高血壓患者動(dòng)態(tài)收縮壓與亮氨酸/異亮氨酸、纈氨酸、L-甲硫氨酸、苯丙氨酸、C0-肉堿和C3-肉堿水平呈明顯正相關(guān),證明了生命早期和晚期支鏈氨基酸代謝改變的不同階段[20]。血漿苯丙氨酸和苯基乙酰谷氨酰胺可用于預(yù)測(cè)冠狀動(dòng)脈支架內(nèi)再狹窄癥,腸道微生物可能是預(yù)防冠狀動(dòng)脈支架內(nèi)再狹窄癥進(jìn)展的干預(yù)靶點(diǎn)[21]。而色氨酸人體必需的外源性芳香族氨基酸,在人體中色氨酸不僅可以合成蛋白質(zhì),還可以通過(guò)其代謝產(chǎn)物參與機(jī)體的情緒調(diào)節(jié)和新陳代謝過(guò)程[22]。研究發(fā)現(xiàn),高血壓患者腸道中代謝產(chǎn)物吲哚乙酸水平明顯降低,予小鼠高鹽飲食后可影響腸道菌群的組成,降低糞便中吲哚乙酸水平,同時(shí)提高小腸內(nèi)促炎性Th17細(xì)胞數(shù)量,刺激炎癥反應(yīng),導(dǎo)致小鼠血壓升高和心血管疾病發(fā)生,故腸道菌群的代謝產(chǎn)物吲哚乙酸對(duì)高血壓的發(fā)生、發(fā)展可能具有抵抗作用[23]。

目前與高血壓密切相關(guān)的代謝產(chǎn)物多為短鏈脂肪酸(short chain fat acids,SCFA),如醋酸鹽、丙酸鹽和丁酸鹽,其主要由膳食纖維、盲腸和結(jié)腸中未吸收的碳水化合物通過(guò)腸道微生物發(fā)酵產(chǎn)生,在高血壓實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ椭锌山档脱獕骸１狙芯康难宀町惔x物中未檢測(cè)到SCFA。研究顯示,SCFA在血漿和糞便中顯示出拮抗結(jié)果,在高血壓受試者中發(fā)現(xiàn)SCFA在糞便中的水平明顯升高,在血漿中的水平較低,表明SCFA吸收效率較低[24]。腸道微生物群通過(guò)SCFA參與高血壓的病理生理學(xué)[25]。丁酸鹽與收縮壓線性相關(guān),不受性別、種族或干預(yù)組的影響,血清或糞便丁酸鹽與血壓呈負(fù)相關(guān),故考慮丁酸鹽是以SCFA為中心的降壓干預(yù)目標(biāo)[26]。研究顯示,原發(fā)性高血壓患者的丙酸鹽水平較低,丁酸鹽水平明顯升高[27],表明丁酸鈉可能通過(guò)調(diào)節(jié)腸道微生物群及其衍生代謝物和腎素-血管緊張素系統(tǒng)來(lái)影響高血壓[28]。另有研究顯示,丙酸鹽可降低血壓,減弱心臟肥大、纖維化、血管功能障礙[29]。膳食鈉減少會(huì)增加循環(huán)SCFA,膳食鈉可能會(huì)影響人類的腸道微生物組,增加的SCFA與血壓降低和動(dòng)脈順應(yīng)性改善有關(guān)。腸道微生物群參與血壓調(diào)節(jié)和高血壓,適度的鈉減少會(huì)增加血清SCFA,使血壓和動(dòng)脈僵硬度降低[30]。目前,補(bǔ)充醋酸鹽可保護(hù)米諾環(huán)素誘發(fā)的高血壓,靶向腸道微生物代謝物可作為預(yù)防高血壓發(fā)展早期干預(yù)措施的新視角,有助于減輕高血壓負(fù)擔(dān)[31]。

本研究受試者為本院彝族高血壓患者和健康對(duì)照者,故差異代謝物與其他研究不完全相同;研究存在樣本量小、單中心研究的不足,此后需要進(jìn)一步開展大樣本量、多中心的臨床研究,以提供更多的科學(xué)依據(jù)。綜上所述,兩組受試者的代謝物和代謝通路存在差異,其可成為其診斷和治療的新靶點(diǎn)。