迷迭香酸通過抑制ROS/NLRP-3炎癥小體信號通路對腦缺血再灌注小鼠的保護作用*

劉 勇,楊 濤,梁艷山,曹興華,柯雪茹,陳 杰,馬曉媛

(新疆醫科大學附屬中醫醫院手術麻醉科,烏魯木齊 830099)

迷迭香為是雙子葉植物綱、唇形科、迷迭香屬植物灌木,其提取物迷迭香酸具有抗氧化、抗炎和免疫抑制作用[1]。前期研究表明,小鼠腹腔注射迷迭香酸可減輕腦缺血再灌注損傷(cerebral ischemia reperfusion injury,CIRI),減輕運動神經元變性[2],但迷迭香酸對CIRI具有保護作用的藥理機制尚不清楚。目前認為氧化應激反應是導致CIRI的重要原因,而活性氧是影響氧化應激的主要因素[3],活性氧可誘導多種生物反應,包括組織損傷、炎癥反應、休克和凋亡。本課題組期望通過觀察不同劑量迷迭香酸對腦缺血再灌注小鼠活性氧自由基(reactive oxygen species,ROS)/Nod樣受體蛋白-3(NOD-like receptor thermal protein domain associated protein-3,NLRP-3)炎癥小體信號通路表達的影響,探討迷迭香酸抑制CIRI的作用機制,為進一步的臨床使用和新藥研發提供依據,現報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1實驗動物

60只體重27～30 g雄性美國癌癥研究所(institute of cancer research,ICR)小鼠購自新疆醫科大學動物實驗室,飼養于清潔環境,晝夜12 h光照節律,自由飲水進食,適應性飼養1周后進行實驗。本實驗通過新疆醫科大學動物實驗倫理委員會批準,實驗操作符合倫理要求,倫理審批編號:IACUC-20210301-27。

1.1.2試劑

迷迭香酸(貨號R4033)購自美國默克公司。超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)1兔多克隆抗體、SOD2小鼠單克隆抗體、熒光探針DHE購自上海碧云天生物技術有限公司。兔抗血紅素氧合酶-1(heme oxygenase-1,HO-1)單克隆抗體、核因子-E2相關因子-2(nuclear factor-E2 related factor-2,Nrf-2)多克隆抗體、caspase-1兔單克隆抗體、GAPDH小鼠單克隆抗體、兔抗NLRP-3單克隆抗體、兔抗凋亡相關斑點樣蛋白(apoptosis related spot like protein,ASC)多克隆抗體、IL-1β小鼠單克隆抗體購自美國CST公司。辣根過氧化物酶(horseradish peroxidase,HRP)標記的多克隆山羊抗兔或山羊抗鼠IgG二級抗體購自武漢谷歌生物公司。

1.2 方法

1.2.1實驗動物分組與給藥方法

按隨機數字表法將60只小鼠分為假手術組、模型組、迷迭香酸10、20、40 mg/kg組,每組12只。迷迭香酸水溶性白色粉末用生理鹽水稀釋成1 mg/mL,采用腹腔注射給藥模式,尾靜脈注射最大劑量不超過0.5 mL,參考前期相關文獻均采用腹腔注射方式。

1.2.2建模方法

手術前用50 mg/kg體重的戊巴比妥鈉對小鼠進行麻醉,手術期間體溫保持在(37.0±0.5)℃。缺血再灌注損傷伴大腦中動脈閉塞,單絲插入持續60 min,大腦中動脈由硅樹脂涂層尼龍單絲制成,該單絲被引入左頸總動脈的切口,并延伸至頸動脈分叉的遠端,以暫時閉塞大腦中動脈。大腦中動脈閉塞60 min后,拔出單絲恢復血流。缺血再灌注損傷治療后,小鼠腹腔注射迷迭香酸10、20、40 mg/kg,24 h后再處死小鼠進行以下研究。將整個腦組織放置于4 ℃冰臺上,或冷凍在液氮中并保存在-80 ℃進行分析,或固定在4%多聚甲醛中進行組織學研究。

1.2.3假手術組小鼠制備方法

采用相同的麻醉和手術方法建模,小鼠模型制備好后,只游離血管,不插入單絲栓線;術后腹腔注射同等容量溫度的無菌蒸餾水。

1.2.4小鼠神經功能學評分測定

用迷迭香酸處理小鼠后,由1名不了解小鼠處理情況的觀察者對其進行評估。小鼠經適應訓練后進行3次重復實驗,每次實驗時間5 min,實驗間隔為30 min。參考Longa的6級5分法評分標準:0分為無神經損傷癥狀,1分為提尾時病灶對側前肢不能完全伸直,2分為提尾時病灶對側前肢屈曲,3分為行走時輕度向癱瘓側轉圈,4分為行走時嚴重向癱瘓側轉圈,5分為不能自發行走、向對側跌倒。

1.2.5ROS檢測

取出腦組織,立即在室溫下用甲醛溶液固定1 d,并用70%乙醇保存,然后用石蠟包埋。在旋轉切片機上將每個標本切成7 μm厚的切片,并安裝在涂有3-氨基丙基三乙氧基硅烷(3-aminopropyltriethoxysilane,APES)的載玻片上。每個部分在二甲苯中脫蠟,在水中乙醇濃度降低的情況下再水化,并用蘇木素-伊紅(hematoxylin-eosin,HE)染色,滑梯上裝有中性香脂。另一方面,腦組織于-80 ℃在APES涂層玻片上制備6 μm厚的冷凍切片。細胞接種在96孔黑色透明的底部微孔板上。處理后,用磷酸緩沖鹽溶液(phosphate buffer saline,PBS)洗滌2次,并用10 μmol/L熒光探針DHE在PBS中培養,然后用外熒光顯微鏡觀察熒光強度。

1.2.6Western blot

將約100 mg冷凍腦組織均勻化于1 mL RIPA緩沖液中,然后以10 000×g離心20 min。用Bradford法測量上清液的蛋白質濃度。總蛋白在沸水中培養5 min。在6%～12%聚丙烯酰胺上分離等量的總蛋白,并電泳轉移至由甲醇預活化的聚偏二氟乙烯(polyvinylidenefluoride,PVDF)膜。用5%脫脂牛奶封閉膜2 h,并在4 ℃下與特定一級抗體孵育過夜。用HRP偶聯的山羊抗兔或山羊抗鼠IgG作為二級抗體(1∶6 000)檢測免疫反應帶。免疫反應帶使用光敏HRP Western blot檢測系統顯示,并使用分子分析軟件通過密度測定法定量。主要抗體包括針對SOD1、SOD2、HO-1、Nrf-2、NLRP-3、ASC、caspase-1、IL-1β的兔和小鼠多克隆抗體。

HO-1、Nrf-2的Western blot是將所取得的實驗小鼠腦組織標本按比例(1 mg∶10 μL)加入裂解液進行冰浴勻漿,4 ℃下12 000×g離心10 min,取上清液用于總蛋白定量測定。10%～12%的十二烷基硫酸鈉(sodium dodecyl sulfate,SDS)-聚丙烯酰胺凝膠電泳(polyacrylamide gel electrophoresis,PAGE)凝膠電泳分離蛋白并轉移至PVDF膜上,5% BSA封閉90 min后,4 ℃孵育一抗Nrf-2(1∶800)、HO-1(1∶1 000)過夜。PBS清洗后37 ℃孵育二抗(1∶5 000)90 min。TBST清洗后顯影、保存圖片并采用Quantity One軟件分析目標蛋白及其同塊膠內參的灰度值,計算相對蛋白表達水平。

1.3 統計學處理

2 結 果

2.1 各組神經功能學評分比較

假手術組術后神經功能學評分均為0分。與模型組比較,迷迭香酸10、20、40 mg/kg組神經功能學評分總體降低,其中迷迭香酸40 mg/kg組總體降低最明顯(P<0.05),見表1。

表1 各組神經功能學評分比較(n=12,n)

2.2 各組腦損傷病理改變及ROS水平比較

與假手術組比較,模型組腦損傷病理評分、ROS水平增高(P<0.05);與模型組比較,迷迭香酸20 mg/kg組ROS水平降低,迷迭香酸40 mg/kg組腦損傷病理評分、ROS水平降低,其中迷迭香酸40 mg/kg組降低最明顯(P<0.05),見圖1。

A:各組病理圖片染色(上排,HE,200×)和熒光顯微鏡觀察ROS水平(下排)結果;B:基于HE標準的病理評分結果;C:用熒光探針DCFH-DA測量ROS水平;a:P<0.05,與假手術組比較;b:P<0.05,與模型組比較。圖1 各組腦損傷病理改變及ROS水平比較

2.3 各組SOD1、SOD2、HO-1、Nrf-2相對表達水平比較

與假手術組比較,模型組SOD1、SOD2、HO-1、Nrf-2相對表達水平降低(P<0.05);與模型組比較,迷迭香酸20 mg/kg組SOD1、HO-1、Nrf-2相對表達水平升高,迷迭香酸40 mg/kg組SOD1、SOD2、HO-1、Nrf-2相對表達水平升高,其中迷迭香酸40 mg/kg組升高最明顯(P<0.05),見圖2。

A:Western blot檢測結果;B:各組SOD1相對表達水平比較;C:各組SOD2相對表達水平比較;D:各組HO-1相對表達水平比較;E:各組Nrf-2相對表達水平比較;a:P<0.05,與假手術組比較;b:P<0.05,與模型組比較。圖2 各組SOD1、SOD2、HO-1、Nrf-2相對表達水平比較

2.4 各組NLRP-3、ASC、caspase-1、IL-1β相對表達水平比較

與假手術組比較,模型組NLRP-3、ASC、caspase-1、IL-1β相對表達水平升高(P<0.05);與模型組比較,迷迭香酸10、20、40 mg/kg組NLRP-3、ASC、caspase-1、IL-1β相對表達水平降低,其中迷迭香酸40 mg/kg組降低最明顯(P<0.05),見圖3。

A:Western blot檢測結果;B:各組NLRP-3相對表達水平比較;C:各組ASC相對表達水平比較;D:各組caspase-1相對表達水平比較;E:各組IL-1β相對表達水平比較;a:P<0.05,與假手術組比較;b:P<0.05,與模型組比較。圖3 各組NLRP-3、ASC、caspase-1、IL-1β相對表達水平比較

3 討 論

隨著生活水平的提高、生活方式的改善及人口老齡化,以高癱瘓率和死亡率為特征的卒中發病率明顯增加[4-5],卒中是成年人嚴重長期殘疾的主要原因[6],腦缺血再灌注模型已被公認為腦缺血模型。根據既往研究,缺血性腦損傷的主要病理機制與氧化應激、興奮性毒性、炎癥、線粒體功能障礙和細胞凋亡有關[7-9],甚至可能在幾分鐘內導致細胞死亡[10-12]。迷迭香酸作為重要的抗氧化劑之一,已被證明可以去除活性氮、過氧亞硝酸鹽和許多其他各種活性氧[13-15],且可通過磷脂酰肌醇三激酶(phosphatidylinositol-3-kinase,PI3K)/絲氨酸/蘇氨酸激酶(serine/threoninekinase,AKT)介導的抗氧化作用對肺缺血再灌注損傷產生保護作用[16-18]。還有研究表明,迷迭香酸通過激活Nrf-2信號通路、減少抗氧化損傷、抑制炎癥反應和抑制肝細胞凋亡[19-20]。此外,其他學者也認為迷迭香酸可通過B淋巴細胞瘤-2基因(B cell lymphoma/leukemia 2 gene,Bcl-2)信號通路對氧化應激和細胞凋亡具有明顯的神經保護作用[21-23]。然而,迷迭香酸是否在腦缺血再灌注誘導的腦損傷中發揮作用且如何發揮作用,目前尚不清楚。

本研究中證實,與假手術組比較,腦缺血再灌注確實會導致腦損傷,并伴有更高的神經功能缺損、腦梗死體積和腦水腫。注射迷迭香酸后,神經功能學評分明顯下降,表明迷迭香酸有逆轉小鼠腦損傷的潛在作用。由于腦缺血再灌注與ROS水平升高和腦水腫密切相關,導致患者預后惡化[24-25]。同時,本研究評估了ROS信號通路,發現當ROS在細胞內積累時,就會產生氧化應激,從而對機體造成損害。本研究還發現,腦損傷小鼠的ROS水平明顯升高,迷迭香酸給藥后ROS水平明顯降低,表明迷迭香酸可通過抑制ROS保護小鼠免受腦缺血再灌注誘導的腦損傷。此外,與ROS比較,受損腦組織標本中的SOD1、SOD2、HO-1、Nrf-2蛋白相對表達水平受到抑制,這表明抗氧化劑水平下調,預防CIRI的能力降低。此外,由于炎癥小體在通過IL-1β釋放調節炎癥反應中的重要作用,ROS調節的NLRP-3信號通路也被進一步評估[26]。本研究發現,NLRP-3信號通路在腦缺血再灌注中被激活,隨后激活其下行信號表達,包括ASC和caspase-1。但注射迷迭香酸后,NLRP-3通路失活,最終導致IL-1β分泌,表明迷迭香酸通過抑制ROS和NLRP-3對腦損傷起到保護作用。

本研究采用Western blot、HE染色和免疫組織化學法分析各組相關指標的蛋白表達和組織標本的損傷情況。結果表明,迷迭香酸通過改變腦缺血再灌注誘導小鼠腦內ROS/NLRP-3信號通路的表達,進而抑制氧化應激對抗腦損傷,這些發現可為研究人員從自然生產功能的角度研究CIRI。

綜上所述,迷迭香酸對CIRI小鼠具有保護作用,保護性作用與抑制ROS/NLRP-3炎癥小體信號通路和抗氧化作用的改善有關,這為將來臨床治療提供了一種有前景的治療策略和途徑。