胡黃連苷Ⅱ減輕阿霉素誘發H9C2心肌細胞損傷的潛在機制研究

陳濼帆,趙金丹,饒 紅

(華中科技大學同濟醫學院附屬梨園醫院心血管臨床醫學中心,武漢 430077)

阿霉素(Doxorubicin,Dox)作為一種蒽環類藥物化療藥物,是臨床最常用的抗腫瘤藥物之一,對淋巴瘤、乳腺癌、白血病、骨肉瘤等多種腫瘤疾病都有明顯療效[1]。然而,Dox具有的嚴重心臟毒性,使其臨床應用方面受到較大限制。急性心臟毒性常導致心律失常、短暫性心功能障礙和心電圖改變,這些改變通常可逆,也可表現為心肌損傷,最終進展為慢性或遲發性心臟毒性。慢性心臟毒性常導致心力衰竭、心功能下降和亞臨床心肌功能下降。Dox引起的心肌毒性與劑量密切相關,最終可能導致進行性心力衰竭和不可逆心功能障礙[2]。過度的氧化應激、炎癥反應、線粒體損傷、自噬、內質網應激、細胞焦亡等多種過程參與了Dox誘發的心臟毒性[3-4]。盡管研究人員對Dox引起心臟毒性的機制進行了廣泛研究,但Dox導致心臟毒性的分子發病機制仍不完全清楚,尚缺乏有效的藥物來預防Dox誘發的心肌損傷。因此,進一步探究Dox致心臟毒性的預防和治療策略及潛在分子機制具有十分重要的意義。

沉默信息調節因子1(silen information reglator 1,SIRT1)是一種依賴于煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(nicotinamide adenine dinucleotide,NAD+)的組蛋白去乙酰化酶,參與組蛋白的共價修飾,并可通過轉錄、翻譯及翻譯后修飾等途徑參與多種疾病病理生理過程[5]。SIRT1在心肌缺血再灌注損傷[6]、心力衰竭[7]、心臟肥厚[8]等多種心血管疾病中發揮了保護作用。SIRT1通過參與多種信號通路(如SIRT1/PGC-1α、SIRT1/TGF-β、SIRT1/p53、SIRT1/NLRP3等)的調控進而減輕Dox誘發的心臟毒性,可能成為研發預防或治療Dox誘發心臟毒性藥物的有效靶點。胡黃連苷Ⅱ(Picroside Ⅱ,Pic)是胡黃連的主要活性成分之一[9],具有抗細胞凋亡、抗炎和抗氧化作用[10-11]。本研究探討Pic通過調控SIRT1緩解Dox誘發的心臟毒性相關機制,為預防或治療提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 材料

Dox、Pic和SIRT1-IN-1(SIRT1選擇性抑制劑)購于美國MCE公司;CCK-8試劑盒、TUNEL染色試劑盒、膜聯蛋白V(Annexin V)-異硫氰酸熒光素(fluorescein isothiocyanate isomer,FITC)細胞凋亡檢測試劑盒、線粒體膜電位(mitochondrial membrane potential,MMP)檢測試劑盒(JC-1)和活性氧檢測試劑盒購于上海碧云天生物科技有限公司;乳酸脫氫酶(LDH)檢測試劑盒購于南京建成生物工程研究;兔抗GAPDH購于美國GeneTex公司,兔抗BAL-2、兔抗SIRT1購于英國Abcam公司,兔抗BAX、兔抗C-caspase-3購于美國Cell Signaling Technology公司;H9C2心肌細胞購于中國科學院細胞庫。

1.2 方法

1.2.1細胞培養及處理

H9C2心肌細胞用含有10%胎牛血清和1%青鏈霉素的DMEM培養基維持培養在5% CO2的37 ℃培養箱,每2天更換新的培養基。當細胞匯合度達到80%～90%時用0.25%胰酶(含乙二胺四乙酸)消化傳代。當細胞匯合度達到60%～70%時,將細胞分為對照組(Con組)、Dox組及不同濃度(5、10、20、40 μmol/L)的Pic治療組(Dox+Pic組),Dox的干預濃度為1 μmol/L,Pic的最佳干預濃度則根據CCK-8檢測結果決定。在進行藥物干預前,用無血清培養基處理H9C2心肌細胞6 h,排除胎牛血清對細胞的促增殖作用,然后用Dox和Pic干預24 h進行后續實驗。為研究Pic是否通過調節SIRT1來改善Dox誘發的H9C2心肌細胞損傷,給予Dox+Pic組SIRT1選擇性抑制劑(SIRT1-IN-1,2 μmol/L)處理24 h(Dox+Pic+SIRT1-IN-1組)。

1.2.2CCK-8檢測細胞活性及LDH水平檢測

將H9C2心肌細胞以1×104個/mL的密度接種到96孔板培養,當細胞匯合度達到60%～70%時,Dox組細胞給與1 μmol/L Dox處理,Pic組給予不同濃度(5、10、20、40 μmol/L)Pic處理,Dox+Pic組給予1 μmol/L的Dox及不同濃度(5、10、20、40 μmol/L)Pic處理,Con組給予等量的二甲基亞砜(DMSO)處理。24 h后,每孔加入100 μL CCK-8工作液,并在37 ℃培養箱孵育90 min,最后用酶標儀在450 nm處讀取每孔的吸光度值,以各處理組吸光度與對照組吸光度之比計算細胞的相對活力。收集各組經過干預的細胞培養液,采用試劑盒檢測細胞培養液中的LDH水平。

1.2.3流式細胞術和TUNEL染色檢測細胞凋亡

收集每組的細胞及細胞上清液,以300 r/min轉速離心5 min,制備成單細胞懸液后用Annexin V-FITC和碘化丙啶(propidiumIodide,PI)進行染色,室溫下避光孵育30 min,通過流式細胞儀檢測細胞的凋亡指數。各組細胞制備細胞爬片,經藥物干預后,用磷酸鹽緩沖液(phosphate buffer saline,PBS)洗滌各組細胞2次,加入含0.3%Triton X-100的PBS,室溫孵育5 min。根據TUNEL試劑盒說明書配制TUNEL檢測液,每孔加入適量TUNEL檢測液,37 ℃避光孵育60 min,孵育結束后PBS洗滌3次,用抗熒光淬滅劑封片后在熒光顯微鏡下觀察。

1.2.4JC-1染色檢測H9C2心肌細胞MMP改變

采用JC-1染色實驗分析H9C2心肌細胞MMP的改變。按照JC-1試劑盒說明書配制JC-1工作液,進藥物處理后的各組細胞中加入適量JC-1工作液,充分混勻,細胞培養箱中37℃孵育20 min;孵育結束后,吸除上清,用JC-1染色緩沖液(1×)洗滌2次,加入適量培養基,最后在熒光顯微鏡下觀察記錄。

1.2.5Western blot檢測蛋白的表達

采用含有蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑的RIPA裂解液提取各組細胞蛋白,通過BCA定量檢測各組蛋白濃度,將提取的蛋白沸水浴10～15 min;十二烷基硫酸鈉(sodium dodecyl sulfate,SDS)-聚丙烯酰胺凝膠電泳(polyacrylamide gel electrophoresis,PAGE)分離蛋白,并用濕轉法將電泳后的蛋白轉至聚偏二氟乙烯(polyvinylidene difluoride,PVDF)膜。采用5%脫脂牛奶室溫封閉2 h,TBST漂洗條帶后在4 ℃過夜孵育一抗。一抗如下:兔抗GAPDH(1∶3 000)、兔抗BAX(1∶1 000)、兔抗BCL2、兔抗C-caspase-3(1∶1 000)、兔抗SIRT1(1∶1 000)。一抗過夜孵育后,采用TBST洗膜3次,每次5 min,辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔的二抗(1∶5 000)室溫孵育2 h,TBST洗膜后用增強化學發光(enhanced chemiluminescence,ECL)化學顯影液檢測蛋白表達,ImageJ軟件分析條帶的灰度值。

1.3 統計學處理

2 結 果

2.1 Pic減輕Dox引起的H9C2心肌細胞損傷

Pic組中,只有高濃度組(40 μmol/L)的細胞活性減弱(P<0.05)。與Con組比較,Dox組細胞活性明顯降低,Dox+Pic組除5 μmol/L亞組外,其他組的細胞活性均較Dox組升高;Dox+Pic組中40 μmol/L亞組的細胞活性較20 μmol/L亞組有所降低,表明Pic在一定濃度范圍內能減輕Dox引起的細胞損傷,據此將20 μmol/L設定為后續實驗中Pic的最佳干預濃度。Dox+Pic組LDH水平低于Dox組(P<0.05),見圖1。

A:Pic化學結構式;B:Con組與不同濃度Pic組細胞活性比較;C:Con組、Dox組及不同濃度Dox+Pic組細胞活性比較;D:Con組、Dox組和Dox+Pic組細胞培養基中LDH水平比較;ns:P>0.05,與Con組比較;a:P<0.05,與Con組比較;b:P>0.05,與Dox組比較;c:P<0.05,與Dox組比較;d:P<0.05,與Con組比較。圖1 Pic減輕H9C2心肌細胞損傷效果圖

2.2 Pic有效抑制Dox誘發的H9C2心肌細胞凋亡和MMP降低

與Con組比較,Dox組的細胞凋亡率明顯升高(P<0.05);與Dox組比較,Dox+Pic組的細胞凋亡率明顯降低(P<0.05);JC-1染色結果顯示,與Con組比較,Dox組細胞JC-1單體增加,同時JC-1聚合物減少,MMP降低,見圖2～4。

A:流式細胞術檢測各組細胞的凋亡率;B:流式結果統計分析圖;a:P<0.05,與Con組比較;b:P<0.05,與Dox組比較。圖2 流式細胞術檢測結果

A:TUNEL染色檢測細胞凋亡;B:TUNEL染色結果的統計分析;a:P<0.05,與Con組比較;b:P<0.05,與Dox組比較。圖3 TUNEL染色結果

圖4 JC-1染色結果

2.3 Pic改善Dox引起的細胞凋亡

Western blot結果顯示,與Con組比較,Dox組細胞促凋亡蛋白BAX和C-caspase-3蛋白表達、BAX/BCL2比值升高,而抗凋亡蛋白BCL2蛋白表達降低,差異有統計學意義(P<0.05);與Dox組比較,Dox+Pic組BAX和C-caspase-3蛋白表達、BAX/BCL2比值降低,BCL2蛋白表達升高,差異有統計學意義(P<0.05),見圖5。

A:Western blot檢測各組細胞凋亡相關蛋白的表達情況;B:3組BAX蛋白表達情況;C:3組BCL2蛋白表達情況;D:3組BAX/BCL2比值;E:3組C-caspase-3蛋白表達情況;a:P<0.05,與Con組比較;b:P<0.05,與Dox組比較。圖5 Pic改善Dox引起的細胞凋亡情況

2.4 Pic通過激活SIRT1改善Dox引起的細胞凋亡

SIRT1-IN-1可以明顯地抑制H9C2心肌細胞SIRT1蛋白表達。Western blot結果顯示,與Con組比較,Dox組SIRT1蛋白表達明顯降低(P<0.05);與Dox組比較,Pic組SIRT1蛋白表達有所上升;與Dox+Pic組比較,Dox+Pic+SIRT1-IN-1組BAX和C-caspase-3蛋白表達增加,BCL2蛋白表達降低,BAX/BCL2比值升高,見圖6。

3 討 論

Dox是臨床上廣泛使用的蒽環類化療藥物,對多種腫瘤具有較好的治療作用,但其具有劑量依賴性心臟毒性,可導致心肌病甚至心力衰竭,這也成為限制Dox臨床應用的主要原因[12]。因此,更加深入全面地了解Dox導致心臟毒性的病理機制、研發Dox的替代藥物或尋求改善Dox心臟毒性的方法仍是研究的當務之急。

Dox所致心肌損傷可分為兩大類:收縮功能障礙和心肌細胞損失。雖然兩者在該疾病進展過程中都非常重要,但心肌細胞損失可能在該疾病的進展中更為關鍵,因為它具有不可逆性,患者預后不良[13]。Dox導致心肌細胞凋亡是心肌細胞損失最為重要的原因之一。本研究發現,Dox導致心肌細胞損傷,表現為細胞活力明顯降低,細胞培養液中的LDH水平明顯上升;Annexin V-FITC/PI染色結果顯示凋亡細胞增加,TUNEL陽性凋亡細胞也進一步證實了這一點。同時,Dox增加了促凋亡蛋白BAX、C-caspase-3的表達,抑制抗凋亡蛋白BCL2的表達,凋亡細胞的MMP會明顯降低,間接證實Dox誘導細胞凋亡。

作為胡黃連的主要活性成分之一,Pic具有抗炎、抗氧化、抗凋亡等作用[14]。Pic可通過MEK-ERK1/2-COX2通路減輕腦缺血性損傷[15],抑制核因子κB改善脂多糖誘發的大鼠肺部炎癥反應[16],抑制氧化信號通路保護血腦屏障[17],激活法尼酯X受體來保護膽汁淤積性肝損傷[9]。此外,Pic還可激活SIRT1減少炎癥、氧化應激和細胞凋亡,進而減輕高同型半胱氨酸血癥誘導的內皮損傷[11]。SIRT1是細胞內重要的去乙酰化酶,通過在肝臟、肌肉、脂肪、心臟等眾多組織中對眾多靶蛋白去乙酰化,在組織代謝中發揮關鍵作用[18]。證據表明,SIRT1可能在心血管疾病中發揮重要的保護作用,可介導多種通路來減輕炎癥、氧化應激、線粒體損傷和細胞凋亡,進而緩解Dox誘發的心肌細胞損傷[19]。本研究結果顯示,Dox能夠明顯降低H9C2心肌細胞中SIRT1蛋白表達,而Pic可以增加SIRT1蛋白表達。當使用SIRT1的選擇性抑制劑后,Pic對H9C2心肌細胞的保護作用被逆轉,證實Pic是通過增加SIRT1蛋白的表達間接發揮對H9C2心肌細胞的保護作用。

Dox所致心臟毒性的病理機制涉及氧化應激、炎癥、細胞焦亡、自噬等多個病理過程。本研究初步通過體外細胞模型證實了Pic能有效地抑制Dox引起的細胞損傷,其潛在機制可能是Pic通過激活SIRT1來減輕Dox誘導的細胞凋亡,這為將來Pic臨床應用于改善Dox所致心臟毒性提供了一定的理論依據。但是Pic能否影響Dox所致心臟毒性過程中的氧化應激、炎癥等其他病理過程尚有待進一步探究。