吳茱萸堿脂質(zhì)體的制備工藝研究

黃秋妹，闕慧卿，李 唯，錢(qián)麗萍，劉經(jīng)亮

（1.廣東食品藥品職業(yè)學(xué)院，廣東 廣州 510520；2.福建省醫(yī)學(xué)科學(xué)研究院藥物所福建省醫(yī)學(xué)測(cè)試重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建 福州 350001）

吳茱萸Evodia rutaecarpa（Juss.）為蕓香科吳茱萸屬植物吳茱萸、疏毛吳茱萸或石虎的干燥近成熟果實(shí)[1]。吳茱萸堿（Evodiamine，EVO）又名吳茱萸胺，是從中藥吳茱萸果實(shí)中提取分離出的一種色胺吲哚類(lèi)生物堿，為吳茱萸的主要活性物質(zhì)之一[2]。現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究表明[3-6]，EVO 具有抗腫瘤、降血脂、降血糖等多種藥理活性，具有極高的藥用價(jià)值。EVO 為脂溶性藥物，幾乎不溶于水，因其在水中的溶解性差影響其生物利用度及其應(yīng)用。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道[7-9]，脂質(zhì)體、納米化、固體分散體等能夠增加難溶性藥物的溶解度以提高其體內(nèi)生物利用度。脂質(zhì)體（Liposomes，LP）是一種具有脂質(zhì)雙分子層包封成的微小囊狀載體制劑，可將水溶性藥物或者脂溶性藥物分別包裹于親水性頭部形成的囊泡或雙分子層膜中，在體內(nèi)具有很好的生物相容性。脂質(zhì)體因具有增加藥物的溶解度、提高包封藥物穩(wěn)定性、提高藥物生物利用度等優(yōu)勢(shì)而成為藥物研究熱點(diǎn)[9-11]。為了提高EVO 的溶解度及其生物利用度，本研究將EVO制備成脂質(zhì)體，主要考察EVO 脂質(zhì)體的制備工藝及含量測(cè)定方法，旨在為EVO 新制劑的開(kāi)發(fā)提供研究基礎(chǔ)。

1 儀器與試劑

1.1 儀器 RE-2000B 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海亞榮生化儀器廠）；SARMT-N 水純化系統(tǒng)（上海康雷分析儀器有限公司）；ML204T/02 分析天平[梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司]；LC-20A 高效液相色譜儀（日本島津）；LGJ-18 冷凍干燥機(jī)（北京松源華興科技發(fā)展有限公司），PALS 高分辨Zeta 電位及粒度分析儀（美國(guó)布魯克海文）。

1.2 試劑 EVO 對(duì)照品（純度≥98%，北京索萊寶科技有限公司，批號(hào)：01222B025），EVO（純度98%，南通飛宇科技有限公司），膽固醇（北京索萊寶科技有限公司），大豆卵磷脂（生工生物工程上海股份有限公司），甲醇、乙腈（HPLC 級(jí)，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司），四氫呋喃，冰醋酸等試劑為分析純，新制超純水。

2 方法與結(jié)果

2.1 EVO 脂質(zhì)體制備方法 采用薄膜分散法制備脂質(zhì)體[12-14]。分別精密稱(chēng)取基質(zhì)（大豆卵磷脂、膽固醇、VitaE）與計(jì)算量EVO，溶于10 ml 氯仿溶液，攪拌使其完全溶解，轉(zhuǎn)移至旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中，45 ℃水浴條件下，常壓旋蒸30 min，緩慢減壓至0.07 MPa，待有機(jī)溶劑全部蒸出，繼續(xù)旋蒸1 h，使脂質(zhì)材料均勻成膜（油相）；量取適量超純水，參考文獻(xiàn)用量加入適量丙三醇（1%）和泊洛沙姆188（0.2%），所得溶液置于40℃水浴中充分溶解、混勻，制備水相。將水相溶液加入油相，40 ℃水浴振蕩充分水化，使薄膜充分溶脹、脫落形成脂質(zhì)體混懸液，混懸液通過(guò)高壓均質(zhì)機(jī)進(jìn)行高壓乳勻，制備EVO-LP 溶液。取適量上述脂質(zhì)體混懸液于凍干管中，加入凍干保護(hù)劑，置于冷凍干燥機(jī)中，冷凍干燥，即得EVO 凍干脂質(zhì)體，4 ℃保存，備用。

2.2 脂質(zhì)體中EVO 的含量測(cè)定

2.2.1 對(duì)照品溶液的制備 精密稱(chēng)取EVO 對(duì)照品適量，加甲醇制成每1 ml 約含EVO0.5 mg 溶液，即得。

2.2.2 供試品溶液的制備 精密量取液體EVO-LP 0.5 ml 于容量瓶中，加入適量甲醇，超聲處理（功率300 W，頻率40 kHz）30 min，放冷后用甲醇定容，搖勻，0.45 μm 微孔濾膜濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得供試品溶液。取空白輔料，按照樣品溶液的制備方法制備陰性對(duì)照溶液。

2.2.3 色譜條件 參考文獻(xiàn)方法[15，16]進(jìn)行實(shí)驗(yàn)條件摸索，確定色譜條件為：Xtimate C18 色譜柱（150 mm×4.5 mm，5 μm），以乙腈-水-四氫呋喃-醋酸（55∶45∶0.8∶0.1）為流動(dòng)相，流速為1 ml/min，柱溫為室溫，進(jìn)樣量5 μl，檢測(cè)波長(zhǎng)225 nm。對(duì)照品、供試品和陰性對(duì)照的HPLC 色譜圖見(jiàn)圖1。

圖1 對(duì)照品、供試品和陰性對(duì)照的HPLC 色譜圖

2.2.4 線(xiàn)性關(guān)系考察精密量 取對(duì)照品溶液，逐級(jí)稀釋至濃度為5.7、11.4、22.8、34.2、57.0 μg/ml 的溶液，按“2.2.3”項(xiàng)下的色譜柱條件進(jìn)行檢測(cè)，以峰面積（Y）為縱坐標(biāo)，質(zhì)量濃度（X）為橫坐標(biāo)進(jìn)行線(xiàn)性回歸，得到方程為Y=228466X-21376，r=0.9999，線(xiàn)性范圍為28.5～285 ng。

2.2.5 精密度試驗(yàn) 取已知濃度的EVO 標(biāo)準(zhǔn)品溶液連續(xù)進(jìn)樣6 次，按照“2.2.3”項(xiàng)目色譜條件測(cè)定峰面積，計(jì)算RSD 為1.3%，表明儀器精密度良好。

2.2.6 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批樣品按照“2.2.2”供試品溶液制備方法制備溶液，按“2.2.3”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣含量測(cè)定，結(jié)果得出峰面積的RSD 為1.8%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.2.7 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一份供試品溶液，按“2.2.3”項(xiàng)下色譜條件，分別于0、2、6、12、24 h 進(jìn)樣測(cè)定色譜峰面積，結(jié)果得出峰面積的RSD 為2.1%，表明供試品溶液的穩(wěn)定性良好。

2.2.8 回收率試驗(yàn) 分別精密移取已知含量的EVOLP 樣品6 份，分別置于10 ml 容量瓶中，分別加入相應(yīng)量的EVO 對(duì)照品（0.57 mg/ml 溶液100 μl），按“2.2.2”項(xiàng)下的方法制備供試品溶液，按照“2.2.3”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行檢測(cè)，計(jì)算樣品回收率為98.25%～101.2%，RSD 為2.8%。

2.3 制劑質(zhì)量評(píng)價(jià)

2.3.1 包封率的測(cè)定[14，17]取適量葡聚糖G-10 充分溶脹、洗滌后，制備微型柱，分離EVO 脂質(zhì)體，得到已包封的EVO 脂質(zhì)體和游離EVO。采用上述含量測(cè)定方法測(cè)定W包、W游和W總，計(jì)算包封率EE（%）和載藥量DL（%）。計(jì)算公式如下：

式中：W總為脂質(zhì)體中EVO 的總量；W包為脂質(zhì)體包封EVO 的含量；W游為游離EVO 的含量；W基質(zhì)為大豆卵磷脂、膽固醇、VitaE 等基質(zhì)的總質(zhì)量。

2.3.2 粒徑與Zeta 電位的測(cè)定 用高分辨Zeta 電位及粒度分析儀掃描，測(cè)定EVO 脂質(zhì)體顆粒的平均粒徑和Zeta 電位。

2.4 均勻設(shè)計(jì)優(yōu)化EVO 脂質(zhì)體制備工藝

2.4.1 評(píng)價(jià)指標(biāo)與評(píng)分標(biāo)準(zhǔn) 從各號(hào)實(shí)驗(yàn)樣品中，隨機(jī)取凍干前脂質(zhì)體樣品10 ml，測(cè)量粒徑（X1）和電位（X2）；采用葡聚糖凝膠微柱分離未包封的EVO，測(cè)定EVO 脂質(zhì)體的包封率（X3）。X1、X2和X3指標(biāo)按0.25：0.25：0.5 的權(quán)重系數(shù)計(jì)算綜合評(píng)分S。

2.4.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì) 根據(jù)文獻(xiàn)及單因素考察結(jié)果，確定影響EVO 脂質(zhì)體的3 個(gè)因素為：磷脂濃度（A），磷膽比（B），藥物濃度（C）。每個(gè)因素在5 個(gè)水平上變化（見(jiàn)表1），按照文獻(xiàn)[18]均勻設(shè)計(jì)要求，選取U5（54）使用表1，2，4 列（表2）安排實(shí)驗(yàn)。

表1 因素水平表

表2 U5（53）均勻?qū)嶒?yàn)試驗(yàn)因素水平表

2.4.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與數(shù)據(jù)分析 以粒徑、Zata 電位和包封率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，進(jìn)行評(píng)分（表3），綜合得分用SPSS 26.0 軟件進(jìn)行多重線(xiàn)性回歸分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)磷脂濃度（μmol/L）對(duì)脂質(zhì)體的綜合評(píng)分的影響有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（=1.326，=62.907，=0.010），磷膽比（M∶M）對(duì)評(píng)分的影響沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（=0.939=5.322，=0.118），EVO 濃度（μmol/L）對(duì)綜合評(píng)分的影響有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（=-6.247，=18.611，=0.034）結(jié)果見(jiàn)表4。結(jié)合分析結(jié)果可得回歸方程式如下:

表3 粒徑、電位、包封率和評(píng)分結(jié)果

表4 分析結(jié)果

分析上述回歸方程式，可以看出X1，X2兩項(xiàng)前的系數(shù)均為正值，X3項(xiàng)前的系數(shù)為負(fù)值，即在考察范圍內(nèi)X1，X2的取值越大；X3的取值越小，Y（綜合評(píng)分）越高，結(jié)合統(tǒng)計(jì)學(xué)結(jié)果，由于X2的變化引起的差異沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，取中間值即可，X3應(yīng)根據(jù)實(shí)際使用需要盡量降低濃度。綜上，優(yōu)化條件擬合為：X1=30 μmol/l，X2=1∶1，X3=0.8 μmol/l。將上述優(yōu)化條件，代入回歸方程式中，得預(yù)報(bào)的優(yōu)化值為：

2.4.4 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn) 按優(yōu)選的工藝條件（X1=30 μmol/L，X2=1∶1，X3=0.8 μmol/L）進(jìn)行試驗(yàn)，制備三批EVO 脂質(zhì)體，并測(cè)定粒徑、電位和包封率，結(jié)果見(jiàn)表5。其平均得分y=91.77，略高于前5 個(gè)試驗(yàn)號(hào)結(jié)果，與預(yù)報(bào)值基本一致，回歸結(jié)果可信，所制備的脂質(zhì)體均勻，穩(wěn)定，最佳工藝條件可行。

表5 EVO-LP 工藝驗(yàn)證試驗(yàn)

3 討論

納米藥物載體是指粒徑在10～1000 nm 的一類(lèi)新型載體，通常由天然或合成高分子材料制成。目前，藥物載體系統(tǒng)已經(jīng)被運(yùn)用于多種給藥途徑，經(jīng)臨床研究發(fā)現(xiàn)，其不僅適用于注射，而且可以用于口服和透皮吸收系統(tǒng)，這體現(xiàn)了納米藥物載體多樣化的利用途徑和對(duì)于提高藥物利用度的有效性、可行性[18]。EVO 為難溶性藥物，本實(shí)驗(yàn)將其包封并通過(guò)高壓乳勻技術(shù)制備成納米脂質(zhì)體，使其均勻分散于水溶液，并凍干保存，后期使用時(shí)通過(guò)加生理鹽水復(fù)溶或制備滴丸等劑型，提高其生物利用度。

包封率是脂質(zhì)體的關(guān)鍵質(zhì)量屬性，能反映出脂質(zhì)體中藥物包封程度的高低。脂質(zhì)體的效用與其物理特性密切相關(guān)，粒徑是脂質(zhì)體的重要物理表征之一，是影響其自身轉(zhuǎn)染效率、藥代動(dòng)力學(xué)性質(zhì)、體內(nèi)特異性分布等眾多參數(shù)的重要指標(biāo)[18]。Zeta 電位是脂質(zhì)體的另一個(gè)重要指標(biāo)，廣泛應(yīng)用于膠體系統(tǒng)的穩(wěn)定性預(yù)測(cè)。因此選擇包封率、粒徑、zeta 電位為本項(xiàng)目的考察指標(biāo)。脂質(zhì)體的粒徑越小，電位越大，則EVO被分散得越均勻，因此本實(shí)驗(yàn)評(píng)分時(shí)將粒徑90 nm評(píng)為100 分，粒徑每增大或減少30 nm 都減10 分；Zeta 電位以-34 mV 為100 分，每升高或者降低6 mV減10 分，按相應(yīng)的權(quán)重系數(shù)計(jì)算綜合評(píng)分。

本研究在前期EVO 脂質(zhì)體單因素考察的基礎(chǔ)上，采用均勻?qū)嶒?yàn)設(shè)計(jì)法設(shè)計(jì)并安排EVO-LP 的制備，測(cè)量每次實(shí)驗(yàn)制劑的綜合得分（Y）與磷脂濃度（X1）、磷膽比（X2）、EVO 濃度（X3），應(yīng)用SPSS 26.0統(tǒng)計(jì)學(xué)方法，建立多重線(xiàn)性回歸方程，并分析和考察EVO-LP 的理化性質(zhì)與磷脂濃度、磷膽比、EVO濃度等變量的關(guān)系，優(yōu)選制備工藝，并通過(guò)實(shí)驗(yàn)得到脂質(zhì)體的粒徑為89.61，Zeta 電位-30.56 mV，包封率86.60%，驗(yàn)證該制備工藝穩(wěn)定可行，為EVO 的新制劑研究提供參考。