妊娠期糖尿病子代臍血外泌體piRNA 表達譜分析

徐磊，張濤，潘海滔，孫想妹，倪蘊勤，單嘉偉，金欣

妊娠期糖尿病（GDM）是一種常見妊娠并發癥，在妊娠期間發現糖耐量異常，并在分娩后恢復[1]。GDM 對孕婦有長期影響，有研究發現具有GDM 史的婦女患2 型糖尿病的風險是正常妊娠婦女的10倍[2]。GDM 孕婦子代也受到長期的影響，有研究表明GDM孕婦子代出現糖代謝紊亂的風險顯著上升[3]。健康和疾病的發育起源（DOHaD）學說認為，在生命發育早期，胎兒暴露于不良的宮內環境可能增加胎兒在成年后患糖代謝紊亂和心血管疾病等慢性疾病的風險[4]。外泌體是一種細胞外囊泡（EVs），含有許多來源于細胞的成分，包括蛋白質、脂質、DNA、mRNA 和piRNA 等，通過細胞分泌與攝入參與細胞間物質和信息傳遞，調節細胞功能[5-6]。外泌體存在于多種體液中，如血液、尿液、羊水、唾液、肺表面活性物質和母乳[6]。在妊娠期間，外泌體可以在母體和胎兒之間運輸，來自母體的外泌體可以對胎兒組織產生作用[7]。PIWI 蛋白相互作用RNA（piRNA）是一類非編碼小RNA，其長度在25 ～31 nt，具有調節基因表達的作用[8]。piRNA 由piRNA 簇經RNA 聚合酶II 轉錄為長鏈非編碼轉錄本，轉錄本從細胞核轉運到細胞質后，定位到靠近細胞核的RNP 顆粒并被加工為成熟piRNA[9]。目前研究認為piRNA 的失調與多種人類疾病有關，包括糖尿病、不孕不育癥、心血管異常、癌癥和神經退行性疾病等[10-11]。胎盤中的piRNA可能調控絨毛侵襲，并與胎盤特異基因的表達有關。此外，其還與miRNA 樣基因表達沉默有關[12]。本研究擬構建正常妊娠和GDM 孕婦子代臍血外泌體piRNA 表達譜，探索piRNA 在GDM 孕婦子代糖代謝紊亂中的作用和臨床意義，現報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 GDM孕婦及正常妊娠孕婦的新生兒臍帶血標本各5 例，取自2020 年1 月至2021 年1 月紹興市婦幼保健院婦產科手術標本。GDM 診斷標準：在妊娠24 ～28 周進行糖耐量試驗（OGTT），OGTT前禁食8 ～12 h，其空腹血糖≥5.1 mmol/L、OGTT 1 h 血糖≥10.0 mmol/L 或OGTT 2 h 血糖≥8.5 mmol/L 即診斷為GDM。排除標準：（1）雙胎妊娠、早產和資料不完整；（2）孕前糖尿病合并妊娠（PGDM）；（3）慢性高血壓，甲狀腺功能異常，肝、腎功能疾病，系統性紅斑狼瘡，多囊卵巢綜合征（PCOS）等；（4）長期使用影響糖代謝的藥物（如類固醇激素）。本研究經紹興市婦幼保健院醫學倫理委員會審批同意，研究對象均已簽署知情同意書。

1.2 外泌體piRNA 測序和序列分析 對從臍血血漿中分離的外泌體小RNA 使用Illumina TruSeq R NA Sample Preparation Kit 試劑盒構建測序文庫，使用Illumina HiSeq X Ten 平臺進行測序，獲得150 bp的雙端數據（測序深度為30X）。使用CASAVA 工具（v1.8 Illumina，San Diego，CA，USA）獲取“Fastq.File”。在數據分析的過程中，在沒有比對到miRBase，且沒有比對到GtRNAdb的序列中挑選長度范圍在24 ～33 bp 的序列，比對到piRNA 簇（來源于piRNA群集數據庫）中，得到潛在的piRNA。從NCBI中獲取已知的piRNA 數據，包括ID 號以及序列信息，對分析得到的潛在的piRNA 進行注釋，得到已知piRNA 簇來源的piRNA。隨后進行數據歸一化處理并篩選高置信度的piRNA，最終得到GDM 組和對照組差異表達的piRNA，并對差異表達的piRNA 進行整體層次聚類分析。利用RNAhybrid 和miRanda 工具預測潛在的piRNA 靶標。使用DAVID 6.8 工具（https://david.ncifcrf.gov） 進行KEGG 通路和GO 分析。

2 結果

2.1 GDM組和對照組臍血外泌體中piRNA的差異表達分析 基于序列相似性，共鑒定到114 個已知piRNA。原始測序數據可在NCBI 的SRA 數據庫中獲得：PRJNA820443。以∣log2FC∣＞1 且P ＜0.05為篩選條件，在GDM 組和對照組之間存在顯著差異表達的piRNA 有7 個，見圖1；其中pir-30625 和pir-36249 表達顯著上調，pir-32512、pir-33437、pir-34789、pir-35549 和pir-61648 表達顯著下調。兩組樣本差異表達piRNA 整體層次聚類圖見圖2。

圖1 GDM 組和對照組間差異表達的piRNA 火山圖

圖2 GDM 組和對照組臍血外泌體差異表達的piRNA 熱圖

2.2 piRNA 的靶基因預測、GO 分析和KEGG 富集分析 預測的靶基因涉及到多個生物學過程，其中大部分富集在轉錄調控、神經系統發育和子宮內的胚胎發育，見圖3a；在分子功能領域，靶基因多數與特定序列DNA 結合有關，見圖3b；另外，靶基因與許多細胞成分有關，見圖3c ～d。

圖3 GDM 組差異表達piRNA 的靶基因進行GO 分析

后續的通路富集分析提示幾個主要涉及的信號通路，如胰島素信號通路、Hippo信號通路、mTOR信號通路、FoxO 信號通路和Wnt 信號通路，見圖4。

圖4 GDM 組差異表達piRNA 的靶基因進行KEGG 分析

3 討論

GDM 是一種常見的妊娠相關疾病，患GDM 的孕婦及其子代出現糖代謝相關疾病的風險相對較高[13]。有研究表明GDM 孕婦子代在青少年時期和成年時

期患2 型糖尿病的風險顯著升高[3]。GDM 孕婦高糖環境引發子代發生代謝紊亂的機制尚未完全闡明。

本研究發現臍血外泌體中存在114 個已知的piRNA。對外泌體piRNA 序列的分析表明，與對照組相比，有7 個piRNA 在GDM 婦女子代臍血外泌體中的表達存在差異，其中pir-30625 和pir-36249 表達顯著上調，pir-32512、pir-33437、pir-34789、pir-35549 和pir-61648 表達顯著下調。進一步分析發現，這7 個差異表達的piRNA靶向4693 個DEG。通過GO分析和KEGG通路分析發現其在胰島素信號通路、Hippo 信號通路、TGF- 信號通路、mTOR 信號通路、FoxO 信號通路和Wnt 信號通路富集。這些信號通路的失調，可能對子代胰腺發育、細胞數量和功能產生不利影響，導致子代糖代謝紊亂。

Hippo 信號通路在產前早期發育階段調控人和小鼠胰腺發育和細胞類型特化[14]。Hippo 信號通路相關蛋白包括TAZ、MST 等。在高糖條件下TAZ 被激活，其通過與PDX1 的協同作用促進胰島素的生成，從而調節葡萄糖穩態。然而，當TAZ缺乏時PDX1的DNA結合能力和轉錄活性降低，從而減少胰島素的生成，破壞了葡萄糖穩態。此外，體外實驗表明TAZ缺失損害了間充質干細胞向胰島素分泌細胞的分化能力；TAZ 敲除小鼠其體質量隨著年齡的增長而異常增加，并加劇其受高脂飲食誘導的葡萄糖不耐受和胰島素抵抗[15]。MST1 是胰腺細胞凋亡的調節因子，在糖尿病患者中MST1 被強激活，與細胞凋亡相關；MST1 在Thr1 處直接磷酸化PDX1，導致其泛素化、降解和胰島素分泌受損[16]。Smad3 是TGF-信號通路相關蛋白，在糖尿病小鼠模型和Min6 細胞系中，Smad3 的缺失保留了胰島中細胞發育介質Pax6的表達，從而提高了細胞的增殖能力和功能[17]。mTORC1 是mTOR 信號通路相關蛋白，在空腹血糖受損患者中胰島mTORC1 活性顯著升高，在糖尿病前期小鼠模型中mTORC1 活性較非糖尿病小鼠顯著增加[18]。在動物實驗中發現細胞特異性mTORC1缺失引起了其增殖、自噬、凋亡和胰島素分泌缺陷，從而導致糖尿病和細胞衰竭。進一步的研究表明mTORC1 通過2 個通路對細胞產生調控作用，其一，通過mTORC1/S6K 通路調控細胞凋亡和自噬；其二，通過mTORC1/4E-BP2-eIF4E 通路調控細胞增殖的機制[19]。MAPK 的不恰當激活被認為在后天的胰島素抵抗發生中發揮重要作用[20]，Map3k12 是MAPK 信號通路相關蛋白，其與Jnk3 結合并激活Jnk3，刺激控制出生后細胞復制的兩個重要細胞周期蛋白Ccnd1 和Ccnd2 的表達，Map3k12 激活Jnk3信號可能是出生后發育和體質量增加過程中調節胰島細胞質量的關鍵機制[21]。去分化是導致細胞衰竭和轉化為非內分泌細胞的主要原因之一，FoxO是維持細胞分化的必要條件；FoxO1 在胰島素抵抗和發育中的胎兒胰腺分化過程中影響胰島細胞[22]。胎兒胰腺細胞的生長和分化，以及成年人胰腺細胞的增殖依賴于-catenin 的功能[23]。這些相關信號通路的變化可能對子代糖代謝產生影響。

綜上所述，本研究首次分析了正常妊娠和GDM孕婦子代臍血外泌體中的差異表達piRNA，并通過生物信息學對差異表達的piRNA 及其靶基因的潛在功能進行預測分析。研究表明，piRNA 可能是潛在的子代糖代謝紊亂生物學標志物，并將進一步擴大樣本量進行驗證。同時，臍血外泌體piRNA 的差異表達可能影響GDM 孕婦子代糖代謝，但差異表達piRNA在GDM孕婦子代糖代謝紊亂中的具體作用和機制仍需深入研究。

利益沖突所有作者聲明無利益沖突

作者貢獻聲明徐磊：論文撰寫、數據整理、統計學分析；倪蘊勤：實驗操作；單嘉偉：實驗操作；潘海滔、孫想妹：研究指導、論文修改；張濤：研究指導、論文修改、經費支持；金欣：研究指導、論文修改