恩格列凈通過自噬-溶酶體途徑改善糖尿病腎病小鼠腎組織損傷

楊 帆,張亞京,張曉云,劉利飛,黃家安,王月華

(1. 河北中醫藥大學中西醫結合學院;2. 河北省中西醫結合肝腎病證研究重點實驗室;3.河北中醫藥大學藥學院;4.河北中醫藥大學中醫臨床技能中心,河北 石家莊 050091)

糖尿病腎臟疾病(Diabetic kidney disease,DKD)是糖尿病最常見的微血管并發癥,也是導致患者進展至終末期腎病,最終應用腎臟替代治療的主要原因之一[1]。鑒于DKD的嚴重不良預后,因此DKD的防治已經成為現代醫學的一項艱巨任務。現代研究發現,在DKD中腎組織固有細胞自噬通路受阻,溶酶體酸化缺陷,無法去除異常和錯誤折疊蛋白質、受損的細胞器及代謝廢物,從而導致腎臟組織學病變[2]。

鈉-葡萄糖共轉運蛋白-2(sodium-dependent glucose transporters 2,SGLT2)抑制劑恩格列凈作為一種新型的口服降糖藥,除了具有降低血糖、血脂,減輕體重的作用外,還可通過改善腎缺氧、降低腎臟高濾過、抑制氧化應激和炎癥等延緩糖尿病并發癥出現及DKD的進展[3]。EMPA-REG OUTCOME試驗證實,恩格列凈不僅顯著降低2型糖尿病合并心血管疾病患者死亡和心衰住院風險,并可延緩腎臟疾病的進展和降低臨床相關腎臟事件的發生率[4]。此外,恩格列凈還可誘導AMP激活的蛋白激酶和沉默信息調節因子1活化,正向調節自噬,維持腎臟細胞的穩態,降低腎臟損傷[5-6],但其對自噬的調控是否通過保護溶酶體途徑實現的尚未可知。因此,本研究上述研究基礎上,通過建立DKD小鼠模型,觀察恩格列凈是否通過調節自噬-溶酶體通路發揮腎臟保護作用。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑恩格列凈片(批號J20171073)購自上海勃林格殷格翰藥業有限公司;微管相關蛋白1輕鏈3B抗體(LC3B,批號ab48394)、p62/SQSTM1抗體(批號ab91526)、Beclin 1抗體(批號ab62557)、Agt7抗體(批號ab133528)、溶酶體相關膜蛋白1抗體(LAMP 1,批號ab25245)、Bcl-2抗體(批號ab32124)、caspase-3抗體(批號ab184787)、Bax抗體(批號ab32503)購自美國Abcam公司;腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α,批號SXR063)、白細胞介素-1β(interleukin-1β,IL-1β,批號SXR026)、單核細胞趨化因子-1(monocyte chemokine-1,MCP-1,批號SXR043)試劑盒均購自上海森雄科技實業有限公司;β-actin 抗體(批號GB11001)、HRP標記羊抗兔抗體(批號GB23303)、磷酸化酶抑制劑和蛋白酶抑制劑批號(批號G2007)、ECL化學發光試劑盒(批號G2014)購自武漢賽維爾生物科技有限公司;BCA 蛋白定量試劑盒(批號A53225)購自美國Thermo Fisher Scientific公司。

1.2 儀器ImagQuant LAS4000型全自動凝膠成像系統(美國通用GE公司);7600-020全自動大型生化分析儀(日本Hitachi公司);BX63+DP72型正置研究級顯微鏡(日本Olympus公司);DYY-6C型電泳儀(北京六一儀器廠);Centrifuge5417R型低溫離心機(德國Eppendorf公司),RM2050石蠟切片機(德國Leica 公司),全自動模塊化石蠟包埋機(德國SLEE公司)。

1.3 實驗動物健康雄性db/db和db/m小鼠(11～12周齡,SPF級),遺傳背景為C57BLKS/J,購自江蘇常州卡文斯實驗動物有限公司,合格證號SCXK(蘇)2021-0013。其中db/db小鼠16只,體質量(45±5)g;db/m小鼠8只,體質量(25±5)g,于濕度50%～70%,溫度(24±1) ℃條件下喂養。小鼠可自由進食進水,并維持12 h光照/黑暗循環。所有動物實驗均在所在機構動物倫理委員會許可的前提下進行,并遵循動物實驗倫理準則。

2 方法

2.1 實驗分組將適應性喂養1周后的db/db小鼠監測尿蛋白均陽性后隨機分為模型組(Model)、恩格列凈組(Empagliflozin),每組8只,db/m組小鼠8只作為正常組(Control)。各組繼續飼喂小鼠維持飼料直至實驗結束,維持飼料主要含蛋白質21.1%,脂肪4.5%,碳水化合物60.6%等;由北京博泰宏達生物技術有限公司提供。

2.2 實驗藥物及干預恩格列凈片溶于蒸餾水中,給藥劑量為10 mg·kg-1·d-1[4],根據給藥劑量配置藥液質量濃度為1 g·L-1(0.1%),每天灌胃1次,連續灌胃8周。正常組和模型組每日用等體積的蒸餾水灌胃。

2.3 標本收集各組小鼠于實驗結束時置于代謝籠中收集24 h尿液,測尿量,EP管分裝后置-80 ℃冰箱保存;并于禁食不禁水12 h后,3%異氟烷吸入麻醉,股動脈取血,脫頸椎處死后,剖開腹腔,完整剪下腎臟,剝離腎包膜,并將腎組織一部分放入4%多聚甲醛中固定,用于光鏡檢測,另一部分腎臟放入 -80 ℃冰箱凍存,用于Western blot檢測。

2.4 觀察指標

2.4.1各組小鼠24 h尿蛋白定量(24 h urine protein,24h-UTP)檢測 將收集的小鼠尿標本在4 ℃離心機中以3 000 r·min-1離心15 min后取上清,按照尿蛋白定量試劑盒的操作說明書測定各組小鼠尿蛋白濃度,然后根據各組小鼠尿量計算24 h-UTP。

2.4.2各組小鼠生化指標檢測 將收集的各組小鼠血液置于全自動血生化分析儀上測定其血糖(fasting blood glucose,FBG)、糖化血紅蛋白(glycosylated hemoglobin,HBA1c)、總膽固醇(total cholesterol,TC)、甘油三脂(triglyceride,TG)、尿素氮(blood urea nitrogen, BUN)、肌酐(creatinine,Scr)水平。

2.4.3各組小鼠血清炎癥因子檢測 將收集的各組小鼠血液,置于離心機中3 000 r·min-1,4 ℃離心10 min分離血清,按照試劑盒說明書測定血清TNF-α、IL-1β、MCP-1水平。

2.4.4各組小鼠腎組織病理變化 將固定24 h后的各組小鼠腎臟組織取出,梯度酒精脫水,石蠟常規包埋并切片(厚度4 μm),然后分別用蘇木精-伊紅(hematoxylin eosin,HE)和Masson染色。光學顯微鏡觀察腎組織病理形態學,Image Pro Plus 6.0軟件被用于對Masson染色的腎病理切片膠原沉積量進行半定量分析。

2.4.5Western blot檢測自噬-溶酶體及凋亡相關蛋白 取小鼠腎組織約50 mg充分研磨后,加入RIPA裂解液與蛋白酶抑制劑后冰上裂解30 min。然后以10 000 r·min-1,4 ℃離心10 min,吸取上清。采用BCA蛋白濃度測定試劑盒測定上清液中的蛋白質量濃度。將吸取的蛋白樣品用上樣緩沖液稀釋后在100 ℃沸水中變性5 min。將適量蛋白樣品電泳分離后轉至PVDF膜上,封閉洗滌后,分別加入p62(1 ∶750)、LC3B(1 ∶600)、Beclin 1(1 ∶600)、Agt7(1 ∶500)、LAMP1(1 ∶500)、Bcl-2(1 ∶750)、caspase-3(1 ∶750)、Bax(1 ∶750)、β-actin(1 ∶1 000)抗體,4 ℃孵育過夜,洗膜,HRP標記的山羊抗兔IgG二抗孵育1 h,洗膜后置于ECL發光液中顯色,使用ImageQuant LAS4000 成像系統拍攝,ImageJ軟件分析條帶灰度值。

Tab 2 Effect of empagliflozin on 24 h-UTP and renal function in DKD

3 結果

3.1 各組小鼠一般情況正常組小鼠活動靈敏,反應迅速,毛色光亮;模型組小鼠出現多飲、多尿、多食,精神萎靡,活動緩慢,反應遲鈍,毛色枯槁;恩格列凈干預后上述情況有明顯改善,反應靈敏,活動量增加,毛色有光澤。

3.2 各組小鼠血糖血脂情況比較如Tab 1所示,與正常組小鼠相比,模型組小鼠FBG、HBA1c、TG、TC均明顯升高(P<0.01);與模型組小鼠相比,經恩格列凈干預后,小鼠FBG、HBA1c、TG、TC均顯著降低(P<0.05,P<0.01)。

3.3 各組小鼠24 h-UTP及腎功能情況比較如Tab 2所示,與正常組小鼠相比,模型組小鼠24 h-UTP、BUN、Scr及KIM-1均明顯升高(P<0.01);與模型組小鼠相比,經恩格列凈干預后,小鼠24-UTP、BUN、Scr及KIM-1均明顯降低(P<0.01)。

3.4 各組小鼠血清炎癥因子水平比較如Tab 3所示,與正常組小鼠相比,模型組小鼠血清IL-1β、TNF-α及MCP-1水平均明顯升高(P<0.01);與模型組小鼠相比,經恩格列凈干預后,小鼠血清IL-1β、TNF-α及MCP-1均明顯降低(P<0.01)。

Tab 3 Effect of empagliflozin on serum inflammatory

3.5 各組小鼠腎組織病理變化情況如Fig 1所示,正常組小鼠腎組織結構正常,未見異常的組織病理學改變;模型組小鼠腎小球基底膜彌漫性增厚,系膜基質及細胞增多,腎小囊腔變窄,部分可見球囊黏連,腎小管空泡變性,間質炎性細胞浸潤,部分間質纖維化。恩格列凈干預后,小鼠腎組織病理改變均有一定程度減輕。Masson染色顯示正常組小鼠腎組織膠原纖維沉積較少,而模型組小鼠腎組織膠原纖維沉積明顯增加(P<0.01),經恩格列凈干預后,DKD小鼠腎組織膠原纖維明顯減少(P<0.01)。

Fig 1 Effects of empagliflozin on renal histopathology in DKD mice(×400)

Fig 2 Effect of empagliflozin on autophagy lysosomal pathway-related proteins in renal tissue of DKD

Fig 3 Effect of empagliflozin on apoptosis-related proteins in renal tissue of DKD

3.6 各組小鼠腎組織自噬-溶酶體途徑相關蛋白表達情況如Fig 2所示,與正常組小鼠相比,模型組小鼠腎組織p62升高,LC3B-Ⅱ/LC3B-Ⅰ、Beclin 1、Agt7、LAMP1降低(P<0.01);經恩格列凈干預后,DKD小鼠腎組織p62降低,LC3B-Ⅱ/LC3B-Ⅰ、Beclin 1、Agt7、LAMP1升高(P<0.01)。

3.7 各組小鼠腎組織凋亡相關蛋白表達情況如Fig 3所示,與正常組小鼠相比,模型組小鼠腎組織caspase-3、Bax升高,Bcl-2降低(P<0.01);經恩格列凈干預后,DKD小鼠腎組織caspase-3、Bax降低,Bcl-2升高(P<0.01)。

4 討論

糖尿病在全球呈快速增長趨勢,據2019年國際糖尿病聯盟報告全球約有4.63億糖尿病患者,預計到2045年將增長至7億,其中有30%～40%的患者會進展為DKD[7]。我國一項2016年的調查研究顯示,在住院患者中糖尿病所引起的慢性腎臟病已經超過原發性腎小球腎炎相關的慢性腎臟病,預估目前的患病人數已達2 400萬以上,并且已成為我國中老年人終末期腎病的首因[8]。目前,DKD的防治主要包括控制血糖、血壓、調脂、抗血小板聚集以及調整生活方式等。雖然血管緊張素受體阻滯劑及血管緊張素轉換酶抑制劑是最常用的可有效延緩DKD進展的藥物,但因其存在升高血鉀、加重腎缺血等不良反應而限制了臨床應用。因此,具有腎臟保護作用的新型降糖藥物的研發越來越受到廣大學者關注。

SGLT2抑制劑恩格列凈是近年來新興的一類口服降糖藥物。其能夠直接作用于腎臟,通過抑制腎臟近曲小管SGLT2蛋白表達,減少腎小管對葡萄糖的重吸收,增加葡萄糖的排泄,在不增加胰島素分泌的情況下降低血糖水平。現代研究發現,恩格列凈還可通過抑制管球反饋,減輕腎臟高濾過,降低腎小球內壓;同時減輕近端腎小管的負擔,抗氧化應激,抑制炎癥反應,調節自噬,增加促紅細胞生成素的產生,改善內皮功能以及輕度生酮等方面減少尿蛋白,延緩DKD的進展[3,5-6]。本研究發現,應用恩格列凈干預后的DKD小鼠血糖、血脂均下降,腎功能改善,尿蛋白排泄降低,同時炎癥因子的表達也降低,這與目前研究發現的恩格列凈的藥理作用相一致。

研究表明,溶酶體功能障礙在多種腎臟疾病發生發展中發揮著重要作用[9]。溶酶體功能受損導致自噬抑制,從而使細胞的各種代謝產物,如受損的細胞器及蛋白質聚集體不能在溶酶體降解、清除和循環,引起各種病理性產物堆積,進而激活炎癥因子的表達活化,從而導致腎臟組織學病變,加速腎小球硬化[10]。Liu等[11]發現,在DKD患者和晚期糖基化終產物刺激的足細胞中自噬活性被抑制,同時糖基化終產物觸發了足細胞溶酶體膜透化,導致酶活性降低、溶酶體酸化缺陷,溶酶體降解自噬體的能力下降。LAMP1可作為溶酶體標記蛋白之一,主要分布在溶酶體膜和內吞體膜。研究顯示LAMP1不僅具有維持溶酶體結構完整性以及溶酶體內pH穩定性的作用,還參與多種細胞內的生理過程,如溶酶體胞吐的調節和自噬囊泡的降解等[12]。此外,Beclin 1、LC3和p62是自噬的關鍵介質,被廣泛用作在正常和病理條件下監測和量化自噬活動的標志物。研究發現由BECN 1基因編碼的Beclin 1蛋白,在自噬囊泡形成的起始階段起中心作用,誘導產生活躍的吞噬囊泡并將自噬相關蛋白定位于吞噬泡[13]。當吞噬泡形成后,Beclin 1結合LC3,LC3前體被半胱氨酸蛋白酶裂解生成LC3-I,LC3-I可與自噬體膜上的磷脂酰乙醇胺共價結合轉變為LC3-Ⅱ[14]。自噬底物p62/SQSTM1作為泛素化蛋白,是泛素化蛋白質、細胞器和微生物的受體,可將被清除的物質與底物受體相結合,然后被轉運至吞噬泡進而被溶酶體水解酶降解,其表達水平與自噬呈負相關[15]。本研究發現,模型組小鼠腎組織p62蛋白升高,Beclin 1、Agt7蛋白、LC3B-Ⅱ/LC3B-Ⅰ比值降低,同時LAMP1表達也降低,應用恩格列凈干預后,逆轉了上述相關蛋白的表達。這表明高糖環境下腎組織自噬-溶酶體通路受阻,自噬底物降解受損,而恩格列凈可改善DKD小鼠腎組織溶酶體結構和功能,促進自噬底物降解,從而發揮腎臟保護作用。

此外,細胞自噬與凋亡密切相關。研究表明,抑制自噬相關蛋白Agt 7的表達導致自噬通量受損,引起線粒體受損和活性氧的積累,從而導致細胞凋亡[16]。Bcl-2是調節細胞凋亡的關鍵蛋白,Bcl-2與Beclin 1結合形成復合物,在內質網應激條件下,Bcl-2磷酸化會導致Bcl-2-Beclin 1復合物解離,從而激活細胞自噬,同時其也可以與Bax/Bad結合形成復合物抑制細胞凋亡,但長時間的內質網應激將導致細胞凋亡途徑的激活[17]。caspases作為細胞凋亡過程中的執行者,caspase-3可以與p62的泛素結合域結合,隨后p62與LC3相互作用將caspase-3募集到自噬體而降解,從而抑制細胞凋亡[18]。本研究發現,模型組小鼠腎組織caspase-3、Bax升高,Bcl-2降低;經恩格列凈干預后,DKD小鼠腎組織caspase-3、Bax降低,Bcl-2升高。這表明恩格列凈可改善DKD小鼠腎組織細胞凋亡。

綜上所述,恩格列凈可通過保護DKD小鼠腎組織細胞溶酶體結構和功能,修復自噬-溶酶體通路,促進自噬底物降解,抑制炎癥因子的產生,進而抑制細胞凋亡,降低尿蛋白排泄,改善腎功能,從而減輕腎臟損傷,發揮腎臟保護作用。

(致謝:本實驗完成于河北省中西醫結合肝腎病證研究重點實驗室,向全體老師和同學們表示感謝。)