香青蘭總黃酮對RAW264.7巨噬細胞泡沫化及炎癥反應的調控作用

杜春妍,趙云麗,阮徐莉,王新春,曹文疆

(1.石河子大學藥學院,2.石河子大學醫學院第一附屬醫院藥學部,新疆 石河子 832008)

動脈粥樣硬化(atherosclerosis,AS)被認為是一種慢性炎癥性疾病,炎癥是AS發生發展過程中主要的生理和病理變化的標志[1]。在AS發展早期階段,多種刺激因素誘導脂質聚集在動脈血管壁部位,誘發的炎癥反應,引起細胞黏附,生成脂質斑塊,引起平滑肌增殖、遷移,引發巨噬細胞泡沫化,致使細胞破裂死亡,細胞因子釋放,炎癥反應發生的同時也影響脂質代謝[2-3]。在AS發生發展中,高水平的氧化低密度脂蛋白(oxidized low density lipoprotein,ox-LDL)可以募集單核細胞,從而促進內皮細胞上黏附分子的表達隨后單核細胞與內膜的黏附,形成AS斑塊[4]。核因子κB (nuclear factor κB, NF-κB)和NOD樣受體家族3(NOD-like receptors 3,NLRP3)炎癥小體是AS發病機理中炎癥和細胞死亡的關鍵調節因子[5],因此,抑制巨噬細胞中NF-κB的活化可減少泡沫細胞的形成,并且抑制細胞凋亡及炎癥的產生[6]。

香青蘭(DracocephalummoldavicaL.)是青蘭屬(Dracocephalum)是唇形科(Lamiaceae)植物的重要成員,新疆地產維吾爾藥,資源豐富,維吾爾名為巴迪然吉布亞(Badiranjbuya),主要用于治療心血管類疾病;香青蘭總黃酮(total flavonoids ofDracocephalummoldavicaL.,TFDM)為香青蘭植物中提取的多種黃酮類成分的混合物,課題組前期研究證明[7],香青蘭中的黃酮成分可調節脂質代謝,減少炎癥介質的生成,達到抑制炎癥的發生或減輕炎癥程度,在抗炎,抗氧化,降血脂方面有明顯效果,可增加斑塊的穩定性,從而起到保護心血管系統的作用。因此本研究基于NF-κB和NLRP3炎癥信號通路,探究TFDM調控炎癥信號通路抗AS的機制,為預防治療AS提供新的途徑。

1 材料與方法

1.1 材料小鼠RAW264.7巨噬細胞購自于武漢普諾賽公司(CL-0190)。TFDM(新疆自治區藥物研究所自知),純度為57%;辛伐他汀(北京Solarbio公司,批號IS0170),HPLC≥98%。DMEM培養基、胎牛血清(美國Thermo Fisher SCIENTIFIC公司,批號為8119446、26010074);ox-LDL廣州奕源生物有限公司,批號20190521);CCK-8試劑盒(北仁化學科技有限公司,批號CK04);IκB α 、NF-κB p65、NLRP3、IL-18、IL-1β 抗體(美國Abcam,貨號分別為ab32518、ab16502、ab214185、ab207323、ab234437);GAPDH、β-actin、山羊抗小鼠IgG、山羊抗兔IgG(北京中杉金橋,貨號分別為19F00411、201050827、140193、141987);TNF-α 、IL-10 ELISA 試劑盒(聯科生物有限公司,貨號分別為EK282/3-01、EK210/4-03)

1.2 儀器Forma 2 系列水套-三氣 CO2培養箱(美國Thermo Scientific公司);BCM-1000-生物凈化工作臺(蘇州凈化設備有限公司);CKX53-倒置型電子顯微鏡(日本OLYMPUS公司)VE-180-垂直電泳及電轉儀(海天能科技有限公司);M200 PRO -多功能酶標儀(瑞士Tecan公司);Gel Doc EZ-Bio- Rad 凝膠成像系統(美國 Bio-Rad);LightCycler480 II-實時熒光定量PCR儀(瑞士Roche公司);TGL-20M-臺式高速冷凍離心機(湘儀離心機儀器有限公司);Axio Imager 2-蔡司全自動正置熒光顯微鏡(德國Zeiss公司);NanoDrop 2000c-微量分光光度計/核酸蛋白測定儀(美國Thermo Scientific公司)。

1.3 方法

1.3.1細胞培養 小鼠RAW264.7巨噬細胞系來自武漢賽諾菲,細胞于 DEME完全培養基(含 10%胎牛血清、100 kU·L-1青霉素和100 g·L-1鏈霉素),并置于5% CO2、37 ℃ 、飽和濕度恒溫培養箱培養。

1.3.2泡沫細胞的建立 以25、50、100 mg·L-1ox-LDL誘導RAW264.7細胞,CCK-8檢測細胞活力。同時將RAW264.7巨噬細胞均勻接種于6孔板內,給藥處理結束后吸去上清,用預冷的PBS多次洗滌細胞,在細胞表面加入固定液(甲醇或4%多聚甲醛),室溫下放置30 min后吸出固定液,用PBS洗2次,待爬片快干時加入提前配好的試劑進行油紅O染色。

1.3.3CCK-8測定細胞毒性 將細胞隨機分為正常對照組(Normal):10 %的正常;模型對照組(Model):給予50 mg·L-1ox-LDL培養24 h;TFDM高、中、低劑量組(TFDM-H,TFDM-M組,TFDM-L):分別加100、50、25 mg·L-1TFDM 1 h后加入終濃度為 50 mg·L-1ox-LDL共同作用24 h;陽性對照組(Simvastatin組):加10 μmol辛伐他汀1 h后加入終濃度為50 mg·L-1ox-LDL共同作用24 h。處理結束后每孔加入100 μL稀釋的CCK-8溶液,繼續孵育2 h,檢測450 nm處的吸光度值。

1.3.4油紅O染色觀察TFDM對巨噬細胞泡沫化的影響 取對數生長期的的RAW264.7細胞,按照“2.3”項下進行分組給藥處理后進行油紅O染色,倒置顯微鏡下察看并拍照記錄,應用Image-Pro Plus 6.0軟件計算染色面積。

1.3.5細胞活性氧的測定 取對數生長期的RAW264.7細胞,將細胞接種于24孔板中的細胞爬片上,按照分組進行處理,于細胞培養箱37 ℃、5% CO2下培養24 h后棄去細胞上清液,用PBS洗滌培養板中細胞2次,加入終濃度為10 μmol·L-1的DCFH-DA液1 mL,于37 ℃培養箱內孵育30 min,用無血清培養基洗3次以去除未結合的DCFH-DA,倒置熒光顯微鏡下拍照并觀察結果。使用Image-Pro Plus(IPP)軟件分析熒光拍照圖片,選擇相同測量面積(Area),以細胞內ROS的Sum IOD值作為結果。

1.3.6ELISA法檢測巨噬細胞上清液TNF-α和IL-10的水平 根據ELISA試劑盒說明書操作,檢測巨噬細胞上清液TNF-α和IL-10炎癥因子的表達。

1.3.7PCR法檢測細胞內NF-κB p65、NLRP3、caspase-1、IL-1β和IL-18 mRNA的表達 按“2.3”項下方法處理細胞后分別提取各組細胞 RNA,逆轉錄為cDNA,PCR擴增,以GAPDH為內參,采用2-ΔΔCt法計算各目的基因的相對表達量。引物序列及擴增產物長度見Tab 1。

Tab 1 Primer information table

1.3.8Western blot法檢測細胞中IκBα、NF-κB p65、NLRP3、caspase-1、IL-1β和IL-18蛋白的表達 分組處理后分別提取細胞總蛋白、漿蛋白、核蛋白,采用BCA法測定其蛋白濃度。蛋白經100 ℃變性處理10 min后,經10%SDS-PAGE電泳分離,200 mA濕法轉膜至PVDF膜上;5%脫脂奶粉封閉1 h,分別加入一抗:IκBα(1 ∶1 000)、NF-κB p65(1 ∶1 000)、NLRP3(1 ∶500)、caspase-1(1 ∶1 000)、IL-18(1 ∶1 000)、IL-1β(1 ∶1 000)、Histone H3(1 ∶1 000)、GAPDH(1 ∶2 000)、β-actin(1 ∶2 000),4 ℃孵育過夜,TBST 漂洗4次,每次5 min,然后加入二抗(稀釋比例1 ∶20 000),室溫孵育1 h,TBST清洗4次,每次5 min;ECL化學發光液法顯影,通過ImageJ 1.6.0軟件對條帶進行灰度值分析。

2 結果

2.1 泡沫細胞模型的確定給予25、50、100 mg·L-1ox-LDL誘導RAW264.7細胞24 h后,結果顯示ox-LDL濃度在50 mg·L-1時的細胞活力在80%以上;油紅O染色結果顯示,正常細胞內未見脂滴;25 mg·L-1誘導的細胞內少見脂滴;50 mg·L-1誘導的細胞脂滴明顯增多,環狀排列在細胞膜內側;100 mg·L-1誘導的細胞大多已經破裂凋亡,細胞核明顯,脂滴遍布分散。確定建立泡沫細胞模型的最佳刺激濃度為50 mg·L-1,此時細胞內充滿橘紅色脂滴,細胞形態如同指環,說明泡沫細胞造模成功。

Fig 1 A: Effects of different concentrations of ox-LDLon proliferation of RAW264.7 cells;B: Oil red O staining results(× 400)

2.2 CCK-8測定細胞活力結果如Fig 2,分組給藥處理后,Model組、TFDM-H組、TFDM-M組、TFDM-L組和Simvastatin組對細胞活力無影響(P>0.05),表明選擇的給藥濃度合適。

Fig 2 Effect of TFDM on viability of RWA264.7

2.3 TFDM對泡沫細胞的影響油紅O染色結果如Fig 3A,脂質會被染成紅色,細胞核會被染成藍色。Normal組細胞內無脂質堆積;Model組細胞內紅色明顯,大量脂質堆積,巨噬細胞泡沫化明顯;TFDM組紅色減少,細胞核明顯,巨噬細胞泡沫化減輕;Simvastatin組細胞內有少量脂質被染成紅色。

與Normal組相比,Model組泡沫細胞脂質明顯,染色面積相對明顯較大(P<0.05);與Model組相比,TFDM組脂質染色面積減少(P<0.05);Simvastatin組脂質染色面積減少(P<0.05)。結果表明TFDM可以減少巨噬細胞脂質吞噬從而減輕巨噬細胞的泡沫化。

2.4 TFDM對巨噬細胞活性氧的影響與Normal組相比,Model組細胞內ROS的含量明顯增加(綠色熒光增強),統計結果顯示差異具有顯著性(P<0.01);與Model組相比,TFDM-H組、TFDM-M組及TFDM-L組的細胞胞內ROS的含量下降(綠色熒光明顯減弱),統計結果顯示差異具有顯著性(P<0.05);Simvastatin組細胞胞內ROS的含量明顯下降(綠色熒光明顯減弱),統計結果顯示差異具有顯著性(P<0.01);TFDM組與Simvastatin組相比差異無顯著性(P>0.05)。實驗結果表明TFDM對泡沫化的巨噬細胞中ROS的產生有明顯的抑制作用。

2.5 TFDM對巨噬細胞上清液中炎癥因子TNF-α和IL-10的影響與Normal組比較,Model組中促炎因子TNF-α表達增加(P<0.001),抑炎因子IL-10表達減少(P<0.001);與Model組比較,TFDM-H組、TFDM-M組及TFDM-L組中促炎因子TNF-α表達均降低(P<0.05),抑炎因子IL-10表達均增加(P<0.05),且呈一定的濃度依賴性;Simvastatin組中TNF-α表達降低(P<0.05),抑炎因子IL-10表達差異無顯著性(P>0.05)。

Fig 3 A: Oil red O staining result (× 400);B: Foam cell oil red O

2.6 TFDM對NF-κB p65、NLRP3、caspase-1、IL-1β和IL-18 mRNA表達的影響與Normal組相比,Model組中的NF-κB p65、NLRP3、caspase-1、IL-18以及IL-1β mRNA的表達升高(P<0.01);與Model組相比,TFDM-H組、TFDM-M組及TFDM-L組的NF-κB p65、NLRP3、caspase-1、IL-18 和IL-1β mRNA的表達均降低(P<0.05),表明TFDM對泡沫化的巨噬細胞中NF-κB p65、NLRP3、caspase-1、IL-1β和IL-18 mRNA表達有明顯的抑制作用;Simvastatin組的NF-κB p65、NLRP3、caspase-1、IL-18和IL-1β mRNA的表達降低(P<0.05);TFDM組與Simvastatin組相比差異無顯著性(P>0.05)。

Fig 4 Effect of TFDM on relative fluorescence intensityof ROS in macrophages,Zeiss positive

Fig 5 Effect of TFDM on expression of TNF- α and IL-10

Fig 6 Effect of TFDM on expression of NF-KB p65, NLRP3,caspase-1, IL-1 β and IL-18

Fig 7 Effect of TFDM on expression of I κ Ba protein andNF- κB p65 in

2.7 TFDM對巨噬細胞中IκBα和NF-κB p65蛋白表達的影響與Normal組比較,Model組的IκBα蛋白表達降低(P<0.01),胞質中NF-κB p65蛋白表達降低(P<0.01),細胞核中NF-κB p65蛋白表達增加(P<0.05);與Model組比較,TFDM-H組、TFDM-M組及TFDM-L組的IκBα蛋白表達增加(P<0.05),胞質中NF-κB p65蛋白表達增加(P<0.01),細胞核中NF-κB p65蛋白表達降低(P<0.05);Simvastatin組中的IκBα蛋白表達增加(P<0.05),胞質中NF-κB p65蛋白表達增加(P<0.05),細胞核中NF-κB p65蛋白表達降低(P<0.05);TFDM組與Simvastatin組相比差異無顯著性(P>0.05)。

2.8 TFDM對NLRP3、caspase-1、IL-1β和IL-18蛋白的表達的影響與Normal組比較,Model組中NLRP3、caspase-1、IL-1β以及IL-18蛋白的表達蛋白表達增強(P<0.01);與Model組比較,TFDM-H組、TFDM-M組及TFDM-L組中NLRP3、caspase-1、IL-1β和IL-18蛋白的表達蛋白表達降低(P<0.05),Simvastatin組中NLRP3、caspase-1、IL-1β和IL-18蛋白的表達蛋白表達降低(P<0.05),TFDM組與Simvastatin組相比差異無顯著性(P>0.05)。

Fig 8 Effect of TFDM on expression of NLRP3, caspase-1,

3 討論

在AS進展中,巨噬細胞是第一個侵襲AS病變的炎癥細胞,并最終成為斑塊的主要組成部分[8]。巨噬細胞泡沫化及其死亡是AS發生發展的關鍵環節,死亡的泡沫細胞會釋放大量的促炎細胞因子和介質,如IL-1β、IL-18和基質金屬蛋白酶[9],這些促炎細胞因子和介質進一步觸發炎癥反應,炎癥因子及細胞因子可進一步激活單核-巨噬細胞,此時的單核細胞收到信號被刺激分化為吞噬ox-LDL以及其他細胞分泌物的巨噬細胞,形成泡沫細胞,并在血管內壁積聚,引起AS斑塊的形成[10]。因此,抑制炎癥在炎癥相關疾病治療中起關鍵作用。TFDM為新疆特種植物藥香青蘭植物中提取的多種黃酮類成分的混合物,而黃酮類化合物廣泛用于防治心腦血管類疾病,其能降低血管的脆性,改善血管的通透性、降低血脂和膽固醇[11-12]等。因此,在抗炎、抗氧化、降血脂方面有明顯效果。基于此,本研究選用ox-LDL誘導小鼠單核巨噬細胞RAW264.7炎癥模型探討TFDM對巨噬細胞泡沫化及炎癥反應的調控作用。

膽固醇代謝的失衡,特別是修飾過的低密度脂蛋白,會導致巨噬細胞功能障礙,核受體激活改變,炎癥反應,最終導致AS[13]。巨噬細胞不僅組裝脂質,還釋放TNF-α、IL-1β、IL-6等促炎細胞因子,進一步刺激血管內皮,促進疾病進展[14]。與此相一致,本研究發現,在ox-LDL的作用下,RAW264.7巨噬細胞內會儲存大量脂質,油紅O染色結果顯示,在50 mg·L-1ox-LDL的作用下可以成功將巨噬細胞轉化為泡沫細胞;而給予TFDM干預后巨噬細胞的泡沫化明顯減輕,細胞內紅色脂滴減少;陽性藥辛伐他汀組干預后巨噬細胞泡沫化相較模型組也明顯減輕,而TFDM與辛伐他汀組差異無顯著性,說明TFDM可以減少巨噬細胞脂質吞噬從而減輕巨噬細胞的泡沫化。ROS具有較強的毒性作用,會破壞細胞生物大分子成分及細胞器,ROS檢測結果顯示,巨噬細胞成為泡沫細胞時會有大量的ROS產生,而給予TFDM干預后巨噬細胞的ROS含量明顯降低,說明TFDM可以減輕ROS的生成。ox-LDL刺激泡沫細胞形成過程中會釋放炎性因子TNF-α,而在給予TFDM干預后,TNF-α的表達也明顯降低;此外,IL-10是重要的免疫調節細胞因子,對炎癥有抑制作用,能抑制T細胞,單核細胞和巨噬細胞的活化和效應功能。而ox-LDL誘導使巨噬細胞中IL-10的表達明顯降低,在給予TFDM后,IL-10的表達明顯升高;表明TFDM對炎癥因子有一定的調節作用,且呈現一定的濃度依賴性。

NF-κB是調節巨噬細胞極化的經典途徑[15]?；罨腘F-κB進入細胞核發揮重要的作用,作為調節炎癥反應、氧化應激和免疫的主要核轉錄因子[16]。有研究報道,TNF-α和IL-1β 等細胞因子的表達受到NF-κB調控,而其也可作為刺激因素,進一步活化NF-κB,造成持續或放大的炎癥反應[17]。本研究結果顯示,ox-LDL可促進NF-κB入核,發揮轉錄調節的作用,導致NF-κB、NLRP3、IL-1β以及IL-18 mRNA表達上調;并且在ox-LDL誘導的巨噬細胞中,NF-κB/NLRP3炎癥信號通路的相關蛋白均被激活,而TFDM干預后,NF-κB p65核蛋白的表達被抑制,且NLRP3、caspase-1、IL-1β以及IL-18蛋白表達明顯被抑制,表明在AS的發生發展中NF-κB/NLRP3炎癥小體信號通路直接的參與了泡沫細胞的形成和巨噬的炎癥反應,而TFDM可以減輕這些炎癥蛋白的表達。此外,NF-κB在諸如類風濕性關節炎、炎性腸病和自身免疫性之類的炎性疾病中起著核心作用[18],抑制NF-κB 的活化可有效的抑制炎癥反應,在諸多疾病中有研究意義。

綜上所述,NF-κB/NLRP3炎癥小體信號通路的激活可促進巨噬細胞向泡沫細胞轉化,導致巨噬細胞死亡,發生炎癥反應,進一步促進AS的發生,而TFDM可以調節相關蛋白的表達,且對ROS的生成以及炎癥因子的生成有明顯的抑制作用,AS發生發展中,NF-κB/NLRP3炎癥小體信號通路會參與泡沫細胞的形成,因此可通過調節NF-κB/NLRP3炎癥小體的激活程度,來改善AS的進展,這為AS新的防治策略以炎癥機制的不同環節為靶向研發新的抗炎藥物用于AS性疾病的治療提供了理論基礎。