降糖丸抑制TGF-β1改善糖尿病腎病小鼠腎損傷及纖維化

任宇晴,唐 堂,李 穎,段應鈴,李 寧,代睿欣,范 輝,蘭 天

(1. 廣東藥科大學中醫藥研究院、廣東省代謝病中西醫結合研究中心、糖脂代謝病教育部重點實驗室、廣東省代謝性疾病中醫藥防治重點實驗室,2. 廣東藥科大學藥學院,3. 代睿欣中醫診所,廣東 廣州 510006)

糖尿病(diabetes mellitus, DM)是全球增長最快的疾病之一,預計到2045年將影響6.93億成年人,其微血管并發癥(如糖尿病腎病(diabetes kidney disease, DKD)、糖尿病視網膜病變等)將會導致DM患者死亡率增加、腎功能衰竭和總體生活質量下降[1]。糖尿病腎病(diabetes kidney disease, DKD)是DM的一種嚴重且高發的并發癥,臨床表現為腎小球結節樣病變、持續白蛋白尿和腎小球濾過率逐漸下降[2],病理特征是腎小球和腎小管細胞中細胞外基質的積累、肥大和纖維化[3]。我國臨床上DKD發病率呈現明顯的上升趨勢,有統計結果顯示,目前全球范圍內DKD發病人數約為4億人,且預計2035年約增至5.92億,在全球人口中占8%～10%[4]。約有30%～40%的DM患者發展為DKD,其中50% 可進展為終末期腎病(end stage renal disease,ESRD)[5-6]。DKD的發生發展與腎臟纖維化進展息息相關,且腎臟纖維化是各種慢性腎臟疾病的重要病理特征和最終病理結果。轉化生長因子-β1(TGF-β1)是介導腎臟纖維化的關鍵因子,Smads 是 TGF-β1信號轉導通路中下游主要效應分子[7]。研究表明當TGF-β1/Smad 信號通路被激活時,機體的生長因子和血管內皮因子表達增多,使得細胞上皮間充質轉化和細胞外基質不斷沉積,進而促進腎臟纖維化,影響腎功能[8],細胞外基質中存在纖維黏連蛋白(fibronectin, FN)及膠原蛋白(collagen),此二者大量分泌時,將促進腎小球硬化和腎間質纖維化的發生與發展[9]。目前,臨床上常通過降低血糖、抑制腎素-血管緊張素-醛固酮系統及降低血壓等綜合措施干預DKD[10],但易出現低血糖等并發癥。因此,開發治療DKD的新型靶向藥物一直是國內外研究的熱點。降糖丸(jiangtang Wan,JTW)是廣東省中醫院代睿欣副主任醫師根據多年臨床經驗得出的簡便效廉的方劑,由黃芪、人參、白術、石斛、黃連、葛根、玉竹、天花粉、生地黃等15味中藥組成,具有益氣健脾、滋陰降火之功效,主治DKD中氣陰兩虛、脾腎陽虛等辯證。本研究旨在評價降糖丸在鏈脲佐菌素(streptozotocin,STZ)合并高脂飲食誘導的DKD小鼠中的治療作用,并探討降糖丸改善DKD腎損傷及腎間質纖維化的作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物32只C57BL6/J小鼠,♂,8周齡,質量(20～26) g,SPF級。動物生產許可證號為SCXK(粵)2021-0057,購自廣東省醫學動物中心。在廣東藥科大學動物中心飼養。實驗設計已經廣東藥科大學(中國廣州)實驗室動物倫理委員會論證(動物倫理號:No.gdpulacspf2017619)。

1.2 藥物及試劑降糖丸(黃芪、人參、白術、石斛、黃連、葛根、玉竹、天花粉、生地黃等15味中藥),飲片購自代睿欣中醫診所,批號為20220608,按比例稱取上述飲片制成丸劑;陽性藥鹽酸二甲雙胍片(規格:0.5 g,批號:ACA5354,中美上海施貴寶制藥有限公司);羧甲基纖維素鈉(批號:20190304,生工生物工程有限公司);葡萄糖(批號:20210901,天津市大茂化學試劑有限公司);STZ(批號:WXBD0304V,美國Sigma公司);Schiff試劑(貨號:DG0004,北京雷根生物技術有限公司),0.5%過碘酸溶液(貨號:DG0001,北京雷根生物技術有限公司)、血肌酐(批號:20210915,南京建成生物技術研究所)和尿蛋白(批號:20210730,南京建成生物技術研究所)檢測試劑盒;高脂飲食(蛋白質19%,脂肪18%,碳水化物50%,廣東省醫學實驗動物中心);FN抗體(Boster,貨號:BA1772,批號:153188),GAPDH抗體(Transgen,貨號:HC307,批號:Q10301),Smad 3抗體(CST, 貨號:9523T,批號:5),p-Smad 3抗體(佰嘉,貨號:IPH2281),辣根酶標記山羊抗兔lgG(H+L)(中杉金橋,貨號:ZB-2301,批號:229760111),DAB顯色液(Thermo Scientific,貨號:1856090,批號:UD283195),HRP標記兔二抗(Promega,貨號:W01B,批號:0000497927),HRP標記鼠二抗(Promega,貨號:W402B,批號:0000502814)。

1.3 儀器One-Touch Ultra型血糖儀(型號:One-Touch Ultra Vue,美國強生);低溫高速離心機(型號:cf1524r,美國SCILOGEX)奧林巴斯熒光顯微鏡(型號:BX51,日本Olympus);多功能酶標儀(型號:1510,美國Thermo Fisher Scientific) ;微型蛋白電泳轉印系統(型號:Power Pac Basic,美國BioRad)。

2 方法

2.1 建立動物模型[11-12]所有小鼠適應性喂養1周,取32只雄性小鼠隨機分為4組,每組8只,即為正常對照組、模型組、二甲雙胍組(陽性藥,200 mg·kg-1)、降糖丸組(1 250 mg·kg-1)。除正常組外,其余小鼠禁食12 h,持續4 d同一時間腹腔注射STZ,50 mg·kg-1,7 d后使用血糖儀檢測小鼠空腹血糖,當小鼠空腹血糖值>11.1 mmol·L-1,表示DM模型建立成功,后續用高脂飲食喂養8周,以誘導DKD模型。降糖丸和二甲雙胍混懸于0.5%羧甲基纖維素鈉(CMC-Na)中,每日固定時間灌胃給藥,給藥劑量如上所述。同時,正常對照組和模型組給予等量等濃度 CMC-Na。持續給藥8 周后,小鼠禁食不禁水,于代謝籠中收集24 h尿液。最后一次給藥后24 h麻醉后眼眶取血,全血在室溫條件下靜置30 min,以3 000 r·min-1離心15 min得到小鼠血清樣本。脫頸椎處死小鼠,取單側腎臟的一半固定在福爾馬林溶液中,4 ℃固定24 h后,以乙醇梯度脫水后包埋在石蠟中,剩余腎臟組織用PBS沖洗,放入液氮速凍后儲存于-80 ℃冰箱中。

2.2 生化檢測收集小鼠24 h尿液并記錄尿液體積。根據試劑盒的說明,檢測24 h尿蛋白及血清中血肌酐、TC、TG水平。

2.3 腎臟組織病理學觀察取各組腎組織石蠟包埋后,切片厚度為4 μm。隨后進行蘇木精-伊紅(hematoxylin-eosin, HE)染色、馬松(masson)染色、糖原(periodic acid-schiff, PAS)染色,使用光學顯微鏡觀察腎臟結構病理改變、腎間質纖維化、腎組織糖原堆積情況并進行組織學分析。

2.4 免疫組化(Immunocytochemistry,IHC)檢測小鼠腎組織中FN的表達將小鼠腎臟石蠟切片經二甲苯及梯度乙醇脫蠟后,使用檸檬酸鹽緩沖液在高溫高壓下進行修復,滴加3%過氧化氫室溫孵育以阻斷內源性過氧化物酶的活性。滴加1% BSA封閉1 h,滴加一抗FN(1 ∶200),4 ℃過夜,室溫孵育二抗1.5 h,PBS涮洗后進行DAB顯色,蘇木素復染,將組織脫水后用中性樹脂封片,于顯微鏡下觀察小鼠腎組織中FN蛋白的表達。

2.5 熒光定量PCR檢測腎臟FN、TGF-β1及Ⅳ型膠原蛋白(Collagen Ⅳ)mRNA表達情況每只小鼠取20 mg腎組織研磨后提取總RNA。隨后將RNA逆轉錄為cDNA,進行熒光定量PCR并測定Ct值。擴增條件:95 ℃反應5 min, 95 ℃反應10 s,60 ℃反應15 s, 72 ℃反應20 s。進行40個周期的循環。結果以β-actin為內參,根據各樣本Ct值,使用2-△△Ct法計算目的基因的相對表達量(△Ct=目的基因Ct值-內參基因Ct值)。引物序列詳見Tab 1。

2.6 蛋白免疫印跡法(Western blot)檢測小鼠腎組織中FN的蛋白表達量剪取小鼠腎臟組織后,加入RIPA裂解液后研磨,離心后收集上清,測定蛋白含量后將總蛋白定量至同一水平。在蛋白樣品中加入5× 蛋白上樣緩沖液,煮沸變性10 min,冷卻至室溫后上樣進行SDS-PAGE凝膠電泳。濕法轉膜后封閉,加入一抗、二抗孵育,最后以GAPDH為內參,測定蛋白的相對含量,使用ImageJ 軟件分析條帶的灰度值。

Tab 1 Primer sequences

3 結果

3.1 降糖丸對DKD小鼠體質量、空腹血糖、腎指數的影響模型組小鼠較正常對照組小鼠體質量明顯降低,血糖明顯升高。與模型對照組相比,降糖丸組和二甲雙胍組小鼠血糖明顯下降,并能夠明顯降低STZ合并高脂飲食引起的腎指數升高(P<0.05)。給藥8 周后,降糖丸明顯降低DKD小鼠空腹血糖(P<0.01)。以上結果說明,降糖丸能夠明顯改善STZ合并高脂飲食誘發的DKD小鼠腎指數及血糖升高,具有明顯的降血糖作用。

Fig 1 Effect of Jiangtang Wan on body weight of DKD mice n=6)

3.2 降糖丸對DKD小鼠的24 h尿量、24 h尿蛋白、血肌酐、血清TC、TG的影響與正常組相比,模型組小鼠24 h尿蛋白量明顯上升(P<0.01),血肌酐明顯上升(P<0.01),血清中TC、TG含量也明顯增加(P<0.01)。給藥降糖丸后,DKD小鼠的腎功能明顯改善,與模型組小鼠相比,降糖丸組小鼠的24 h尿蛋白量明顯降低(P<0.05),血肌酐值明顯降低(P<0.01),血清中TC含量明顯降低(P<0.01),血清中TG含量明顯降低(P<0.01)。這表明降糖丸給藥后能明顯保護DKD小鼠腎功能,并調節DKD小鼠的脂代謝紊亂,從而發揮對DKD的治療作用。

Tab 2 Effect of Jiangtang Wan on fasting blood glucose, kidney/body weight of DKD mice n=6)

3.3 降糖丸對DKD小鼠腎組織形態、糖原沉積、腎間質纖維化的影響病理染色顯示,STZ組小鼠腎組織中腎小球基質增生,系膜擴張,球囊壁粘連,炎性細胞大量浸潤;腎間質出現大面積纖維化;腎小球及腎小管出現糖原大量堆積,腎小球基底膜增厚,腎小管基底膜增厚。降糖丸給藥后能明顯逆轉上述變化,尤其體現在改善腎間質纖維化方面,表現類似出陽性藥效果。以上結果表明,降糖丸能夠良好的改善DKD小鼠體內腎臟病理損傷及腎間質纖維化。

3.4 降糖丸對小鼠腎組織中FN表達的影響模型對照組小鼠腎組織中FN的陽性著色程度明顯升高,較對照組差異明顯(P<0.01)。與模型組相比,陽性藥組及降糖丸給藥組均可明顯減少小鼠腎臟中FN的陽性表達(P<0.01),提示降糖丸可明顯抑制DKD小鼠腎組織中FN的表達。

3.5 降糖丸在轉錄水平上對DKD小鼠腎組織中FN、TGF-β1、Collagen Ⅳ的影響在mRNA水平上,與對照組相比,模型組FN表達明顯升高(P<0.01),TGF-β1明顯升高(P<0.01),給藥降糖丸后,DKD小鼠腎組織中FN,TGF-β1與Collagen Ⅳ在mRNA水平上均明顯下調(P<0.01,P<0.05),提示降糖丸可能是通過調節DKD小鼠腎組織中FN,TGF-β1與Collagen Ⅳ的轉錄水平表達,從而影響DKD小鼠的疾病發展。

3.6 降糖丸對DKD模型小鼠腎臟FN 、Smad 3及p-Smad 3蛋白表達的影響模型對照組小鼠腎臟中FN、Smad 3及p-Smad 3的蛋白表達明顯上調,較正常組差異明顯(P<0.01或P<0.05);與模型組相比,降糖丸組和二甲雙胍組小鼠腎臟組織中FN、Smad 3及p-Smad 3蛋白的表達明顯下調(P<0.01),見Fig 4、Tab 6。

Tab 3 Effect of Jiangtang Wan on 24-hour urine volume, 24-hour urinary protein quantity, serum creatinine, TC, TG of DKD mice n=6)

Fig 2 Effect of Jiangtang Wan on renal pathological changes in DKD mice (HE, 400×; PAS, 400×; Masson, 400×)

Fig 3 Effect of Jiangtang Wan on expression of FN in renal tissue of mice (IHC, 400×)

Tab 4 Effect of Jiangtang Wan on positive expression of FN in renal tissue of DKD mice

Tab 5 Effect of Jiangtang Wan on mRNA expression of FN, TGF-β1 and Col Ⅳ of DKD mice n=6)

4 討論

DM發病機制復雜,但目前研究認為高血糖在DKD的發病早期及晚期中都具有關鍵作用[13]。高血糖狀態可改變細胞內的代謝,包括影響葡萄糖代謝、脂代謝、線粒體呼吸鏈功能和呼吸鏈蛋白的解耦連等。病理情況下,持續的高血糖狀態會明顯增加糖基化終末產物(advanced glycation end products,AGEs),同時,腎功能受損時對AGEs清除能力降低,最終導致AGEs大量蓄積。高血糖狀態同時將會激活腎素-血管緊張素-醛固酮系統中的主要活性產物血管緊張素Ⅱ(angiotensin Ⅱ,AngⅡ),活化的AngⅡ通過上調TGF-β1促進腎間質纖維化[14],從而參與DKD的發生和發展。目前大量研究表明,DKD患者的治療應注重嚴格的血糖控制及高血壓治療,已有報道強化血糖控制可預防2型DM患者發展為終末期腎病[15]。二甲雙胍是2型DM降血糖的首選藥物,其降血糖作用已經臨床證實,但當患者腎功能不全時,二甲雙胍的腎臟清除率下降,血漿中二甲雙胍濃度上升,增加乳酸性酸中毒風險[16]。臨床上,血管緊張素受體阻滯劑(angiotensin receptor blocker, ARB)及鈉-葡萄糖協同轉運蛋白2抑制劑(sodium glucose cotransporter 2 inhibitor, SGLT2i)也是DKD的常規治療藥物。ARB可發揮抗炎、抗纖維化作用,延緩尿蛋白進展,明顯改善腎臟功能,降低心血管疾病風險,控制血壓,但對血糖并無影響。SGLT2i類藥物能夠通過影響線粒體功能明顯改善腎功能,延緩慢性腎病發展,同時能夠降低血糖,改善DKD患者的高血糖狀態[17]。在本研究中,降糖丸能夠明顯降低DKD小鼠的空腹血糖水平,并且在減少DKD小鼠尿量、降低小鼠24 h尿蛋白、降低小鼠血肌酐、降低TGF-β1表達方面略優于二甲雙胍,但對于DKD小鼠血尿素氮并無明顯影響。

Fig 4 Effect of Jiangtang Wan on protein expression of FN, Smad 3 and p-Smad 3 of DKD mice

Tab 6 Effect of Jiangtang Wan on protein expression of FN, Smad 3 and p-Smad 3 of DKD mice n=3)

降糖丸由多味中藥組成,其中主要成分為黃芪、人參、白術、石斛、黃連、葛根、玉竹、天花粉、生地黃,本方組成特點在于兼顧陰虛的病機的同時,尤其重視脾胃的功能,與傳統中醫所認為的陰虛為主要病機有所區別。脾胃是升清降濁的樞紐,脾胃功能受損,氣血陰液無法充盛,則表現為陰虛。因此,在治療DKD時,不僅要注重養陰清熱,還必須兼顧脾胃功能,故黃芪、人參、白術的應用是該方的特殊之處;石斛、黃連、葛根、玉竹、天花粉則主要用于清除胃火,同時生地黃能夠補腎陰、降腎火。同時,現代藥理學研究表明上述藥物具有一定的降糖作用[18],可以保護腎臟。綜合而言,該方除清肺熱外,對清胃熱、治療腎陰虧虛均有兼顧,用以針對目前DM發現較早、肺陰虛表現不明顯的情況,顧護中焦,恢復脾胃的升清降濁功能則是本處方的特殊之處,也是對傳統中醫藥理論的創新和發展。

綜上所述,本研究證明降糖丸可以減輕病理狀態下腎間質纖維化,進而明顯延緩DKD的病理進程,其機制可能與抑制TGF-β1與FN的表達有關。然而本研究存在一定的局限性,需要對降糖丸有效成分進行分析,明確降糖丸對于DKD模型中腎臟系膜細胞、腎小管上皮細胞、足細胞、內皮細胞的保護作用,設置多個劑量驗證降糖丸的量效關系,探究降糖丸治療DKD的具體分子機制,使其在患者體內發揮更精準的治療作用。