DAPT對慢性社會挫敗應激誘導小鼠抑郁樣行為的作用及機制

黃 靜,李 永,何 鑫,段文馨,吳文寧

(安徽醫科大學基礎醫學院藥理學教研室,安徽 合肥 230032)

抑郁癥是一種常見神經精神疾病,據世界衛生組織數據顯示,全球抑郁癥患者高達3.5億,并且在青少年中越來越高發;在新冠疫情暴發后,抑郁癥的患病人數更是大幅增加。該病的主要特征是連續且長期的情緒低落、興趣減退[1],表現出認知功能障礙、神經元損傷和植物性癥狀,并且具有很高的自殺傾向[2]。抑郁癥明顯增加了患者家庭及社會的負擔,嚴重損害了人們的生活質量。目前,臨床上用于抑郁癥治療的藥物主要包括5-羥色胺再攝取抑制劑(selective serotonin reuptake inhibitors, SSRIs)、5-羥色胺和去甲腎上腺素再攝取抑制劑(serotonin and norepinephrine reuptake inhibitors, SNRIs)、去甲腎上腺素和特異性5-羥色胺能抗抑郁藥(noradrenergic and specific serotonergic antidepressants, NaSSAs)等[3]。然而,由于藥物不良反應大、療效不佳等原因使得患者的依從性不高。因此,闡明抑郁癥的潛在發病機制,篩選出新的作用靶點和藥物,是目前迫切需要解決的熱點問題,對抑郁癥的治療及臨床合理用藥至關重要。

DAPT(GSI-IX)是一種小分子γ-分泌酶(γ-secretase)抑制劑,γ-分泌酶是一種高度保守的膜包埋蛋白酶,具有切割受體細胞內結構域的活性。DAPT作為一種有效的、特異性的γ-分泌酶抑制劑,可以通過間接抑制γ-分泌酶介導的Notch切割來抑制Notch信號通路[4],進而影響細胞信號傳導和細胞分化,還可誘導細胞自噬和凋亡。研究表明,DAPT具有抗炎以及神經保護作用,可用于自身免疫性疾病、淋巴增生性疾病[5]、腎臟疾病[6]、神經損傷[7]和癌癥[8]等疾病的治療,改善患者癥狀。最近研究表明,DAPT對改善阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease, AD)的癥狀起重要作用[9]。但是DAPT對抑郁癥的確切作用及機制尚未被闡明。因此,本課題通過慢性社會挫敗應激(chronic social defeat stress, CSDS)建立小鼠抑郁模型,研究DAPT對小鼠抑郁樣行為的作用,并探究其可能的作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物6～8周齡雄性C57BL/6J小鼠(體質量為19～24 g)和雄性CD1小鼠(7～8月齡),均從安徽醫科大學SPF級別實驗動物中心處獲得,合格證號分別為:SYXK(皖)2017-006和SYXK(皖)2020-001。實驗所用動物均飼養在12/12 h光暗循環、恒溫(22～24 ℃)和適當濕度(55%～65%)的SPF級別環境下。本課題涉及到的所有與動物相關的實驗,均依照安徽醫科大學實驗動物倫理委員會的相關規定進行。

1.2 藥物與試劑DAPT(MCE,208255-80-5);NLRP3抗體(兔,Cell Signaling Technology,15101S);ASC抗體(兔,Cell Signaling Technology,67824S);caspase-1抗體(兔,Abcam,ab1872);TNF-α抗體(兔,Abcam,ab6671);p62抗體(兔,Cell Signaling Technology,23214S);Atg5抗體(兔,Cell Signaling Technology,12994S);Atg7抗體(兔,Cell Signaling Technology,8558S);Beclin1抗體(兔,Cell Signaling Technology,3495S);β-actin抗體(小鼠,Affinity,T0022);山羊抗小鼠抗體(中杉金橋,ZB-2305);山羊抗兔抗體(中杉金橋,ZB-2301);Western blot一抗稀釋液(江蘇碧云天生物技術公司,P0023A);SuperSignalTMWest Femto化學發光試劑盒(賽默飛世爾科技公司,34096);IL-1β ELISA試劑盒(ELK Biotechnology,ELK1271);IL-18 ELISA試劑盒(ELK Biotechnology,ELK2269)。

1.3 實驗儀器ANY-maze動物行為追蹤分析系統(美國Stoeling公司);Spectra Max 190全波長酶標儀(美谷分子儀器公司);Allegra X-15R高速冷凍離心機(美國Beckman公司);Western blot全套實驗裝置(美國Bio-Rad公司);ChemiDocTMMP Imaging System(美國Bio-Rad公司)。

1.4 抑郁模型的建立CSDS是目前最常用的抑郁模型的建立方法,具體方法如下:將一只C57小鼠與一只具有攻擊性的CD1小鼠放在中間用穿孔的透明塑料隔板隔開的鼠籠中,適應1～2 d后開始造模。每天拿掉隔板,因體質量和月齡的差異,CD1鼠會攻擊C57小鼠,每天允許攻擊時間為10 min。結束后用隔板將二者分開,以防身體接觸,但允許視覺、嗅覺和聽覺接觸。24 h后,C57小鼠將接受另一從未接觸過的CD1鼠的攻擊。持續時間為10 d,10 d后采用社會接觸實驗篩選出CSDS敏感型小鼠用于后續的實驗。

1.5 行為學測試

1.5.1社會接觸實驗(social interaction test, SIT) 用于篩選出CSDS模型建立后的敏感型小鼠。在開放箱(48 cm×45 cm×50 cm)一邊的中間位置放入一個透明的隔離盒(10 cm×6 cm,四周有透氣小孔,用來放CD1小鼠),以隔離盒為中心,在其四周畫出一個大小為14 cm×26 cm的矩形作為社會接觸區。第一階段不放入CD1鼠,放入C57實驗小鼠后開始計時,讓其自由探索2.5 min,記錄實驗小鼠進入接觸區的累積時間。第二階段放入一只從未和實驗小鼠接觸過的CD1鼠,然后再把上一階段的實驗小鼠放入其中,計時2.5 min,記錄該階段實驗小鼠進入接觸區的累積時間。社會接觸率等于目標存在期小鼠在接觸區的累積時間/目標缺席期小鼠在接觸區的累積時間。

1.5.2曠場實驗(open field test, OFT) OFT是評估小鼠對于新環境的探索和緊張度及情緒變化的方法。將OFT反應箱(96 cm×96 cm×50 cm)平均分成9個方格。實驗開始前小鼠需要適應至少半小時。首先在安靜的環境下將小鼠放入反應箱中,讓其在箱中自由活動2 min,觀察并記錄小鼠在3 min內的移動總距離、穿越規定的網格線的次數以及在中間方格區域停留的時間等。每只小鼠測試完成后,用75%的酒精清理反應箱然后用干抹布擦干。

1.5.3糖水偏愛實驗(sucrose preference test, SPT) SPT是評估小鼠快感缺失程度的指標。首先將裝有1%的蔗糖水和普通自來水的2個水瓶放在同一只鼠的鼠籠上,小鼠自由飲用24 h,在此期間每6 h互換兩個水瓶的位置,盡量減少小鼠因為位置喜好而造成測量結果的誤差。訓練階段結束后,把所有水瓶取下對所有小鼠斷食斷水12 h。然后將兩個水瓶分別裝入等體積的1%的蔗糖水和自來水,放在鼠籠上讓小鼠自由飲用12 h,之后測量出每只小鼠的糖水和水的消耗量。糖水偏愛率用糖水消耗量/(糖水消耗量+自來水消耗量)來表示。

1.5.4強迫游泳實驗(forced swimming test, FST) FST是評判小鼠絕望程度的指標。將小鼠單獨放在一個透明的玻璃圓筒中(直徑25 cm),筒內裝入30 cm深的水(水溫保持在25 ℃左右),在安靜的環境下將小鼠放入其中,讓小鼠自由游泳6 min,前2 min為適應階段,然后記錄后4 min小鼠的累積不動時間。

1.5.5懸尾實驗(tail suspension test, TST) TST同樣是測試小鼠的絕望程度。在小鼠尾部(約1 cm)處用膠帶固定,將其懸掛在測試儀器上,使小鼠頭部距離實驗臺面約15 cm,在安靜的環境中保持小鼠懸掛6 min,前2 min為適應階段,然后記錄后4 min小鼠的不動時間。

1.6 Western blot檢測行為學測試結束后,將各組小鼠處死后取出腦組織,冰上剝離出海馬組織,進行冰凍研磨、裂解,按照BCA蛋白濃度定量試劑盒說明書測定蛋白質濃度,并根據濃度算出對應的上樣量。具體步驟為:點樣、凝膠電泳(70 V, 1 h; 120 V, 1 h)、轉膜(200 mA, 40 min; 200 mA, 1 h)、封閉(5%脫脂奶粉,室溫1 h)、一抗4 ℃孵育過夜(NLRP3、ASC、caspase-1、TNF-α、p62、Atg7、Atg5、Beclin1)、TBST洗膜、孵育對應的二抗(室溫1 h)、TBST洗膜,最后將膜放在配好的顯影液中進行孵育顯影,保存條帶圖。ImageJ分析軟件進行分析,β-actin作為內參條帶。

1.7 ELISA檢測取新鮮小鼠海馬組織進行冰凍研磨、裂解、離心后取出上清備用。試劑盒和樣本室溫平衡后,打開酶標板,每孔加入標準工作緩沖液100 μL或樣品100 μL,37 ℃孵育80 min。之后棄去酶標板中液體,每孔加入200 μL洗滌緩沖液,洗滌3次。拍干后每孔加入100 μL生物素化抗體工作液,37 ℃孵育50 min。接著棄去酶標板中液體,每孔加入200 μL洗滌緩沖液,洗滌3次。拍干后每孔加入100 μL HRP酶工作液,37 ℃孵育50 min。棄去酶標板中液體,每孔加入200 μL洗滌緩沖液,洗滌5次。拍干后每孔加入90 μL TMB,37 ℃孵育20 min。最后在每孔中加入50 μL終止液,450 nm波長下立即讀數并計算結果。

1.8 動物分組與處理在抑郁模型建立的實驗中,將C57BL/6J雄性小鼠分為control組和CSDS組兩組,每組12只小鼠;在研究DAPT抗抑郁的實驗中,將C57BL/6J雄性小鼠分為4組,分別為control組、陰性對照組(DAPT組)、模型組(CSDS組)、抑制劑組(CSDS+DAPT組),每組10只小鼠。DAPT組和CSDS+DAPT組在造模期間每天1次腹腔注射給抑制劑DAPT(5 mg·kg-1)。

2 結果

2.1 CSDS誘導小鼠抑郁樣行為為了明確DAPT是否具有抗抑郁作用,我們首先通過CSDS建立小鼠抑郁模型。結果如Fig 1所示,與對照組相比,CSDS處理10 d后小鼠的體質量明顯降低,社會接觸率和糖水偏愛率也明顯降低,FST和TST不動時間顯著增加;同時,在OFT中,CSDS處理組小鼠總的移動距離和在中央區域停留的時間均明顯少于對照組小鼠,這些結果表明,CSDS誘導小鼠出現明顯的抑郁樣行為,提示抑郁模型建立成功。

Fig 1 CSDS induced depressive-like behavior in n=12)

2.2 DAPT改善CSDS誘導的小鼠抑郁樣行為接著我們給予小鼠腹腔注射DAPT,觀察其對小鼠抑郁樣行為是否具有改善作用。如Fig 2所示,DAPT處理明顯抑制CSDS誘導的小鼠體質量減輕、社會接觸率和糖水偏愛率的降低;同時,在FST和TST中,DAPT處理也明顯縮短了CSDS組小鼠的不動時間。而DAPT單獨使用對小鼠的體質量、社會接觸率、糖水偏愛率以及強迫游泳、懸尾的不動時間均無明顯影響,這些結果表明,DAPT改善了慢性應激誘導的小鼠抑郁樣行為。

Fig 2 DAPT ameliorated CSDS-induced depressive-like behavior in n=10)

2.3 DAPT增加抑郁小鼠的自主活動能力如Fig 3所示,在OFT中,CSDS組小鼠的總移動距離、穿線次數以及在中央區域的總時間均較對照組明顯減少,而DAPT處理明顯增加CSDS組小鼠總移動距離、穿線次數以及在中央區域的停留時間,這些結果表明,DAPT可以改善慢性應激誘導小鼠的自主活動能力減弱。

Fig 3 DAPT increased locomotor activity of depressive-like mice induced by n=10)

2.4 DAPT抑制CSDS誘導小鼠海馬組織中NLRP3炎癥小體的激活研究表明,NLRP3炎癥小體在抑郁癥的發生發展中起重要作用。為了進一步探究DAPT抗抑郁癥作用的機制,我們觀察了其對小鼠海馬NLRP3炎癥小體激活的影響。如Fig 4所示,與對照組相比,CSDS組小鼠海馬組織中NLRP3, ASC和caspase-1的蛋白表達是明顯上調的,提示NLRP3炎癥小體被激活,DAPT處理明顯降低了這些蛋白的表達,而DAPT單獨處理不影響這些蛋白的表達,這表明DAPT抑制了CSDS誘導的海馬NLRP3炎癥小體激活,提示DAPT的抗抑郁作用可能與其抑制NLRP3炎癥小體激活有關。

Fig 4 DAPT inhibited NLRP3 inflammasome activation in depressive-like mice induced by

2.5 DAPT減輕CSDS誘導小鼠海馬組織中炎癥因子的表達作為免疫炎癥反應過程中的關鍵信號分子,NLRP3炎癥小體激活可促進IL-1β、IL-18、TNF-α等多種致炎因子的成熟釋放,進而介導一系列的炎癥反應,參與包括抑郁癥在內的多種炎癥性疾病的發生。因此,我們進一步觀察了DAPT對上述炎癥因子表達的影響。如Fig 5所示,與對照組相比,CSDS組小鼠海馬TNF-α的蛋白表達、IL-1β和IL-18水平均明顯升高,DAPT處理能明顯降低CSDS小鼠TNF-α、IL-1β和IL-18的表達,而DAPT單獨處理不影響這些炎癥因子的表達。這些結果表明,DAPT的抗抑郁作用可能是通過抑制NLRP3炎癥小體介導的炎癥反應來實現的。

Fig 5 DAPT inhibited expression of inflammatory cytokines in depressive-like mice induced by n=3)

Fig 6 DAPT activated autophagy in hippocampus of depressive-like n=3)

2.6 DAPT增加抑郁小鼠海馬的自噬水平自噬功能的改變是抑郁癥發生發展過程中的一個重要因素。因此,為了深入探究DAPT改善慢性應激誘導小鼠抑郁樣行為的可能機制,我們觀察了其對自噬相關蛋白p62、Atg7、Atg5和Beclin1表達的影響,如Fig 6所示,CSDS組小鼠海馬Atg7、Atg5和Beclin1蛋白表達水平較對照組明顯降低,p62表達則明顯增加,DAPT處理則明顯增加CSDS組小鼠Atg7、Atg5和Beclin1蛋白的表達,降低p62表達水平,而DAPT單獨處理不影響上述自噬相關蛋白的表達,提示DAPT的抗抑郁作用可能與其增加海馬自噬功能相關。

3 討論

抑郁癥是由多種因素引起的一種情感障礙性疾病,發病機制尚不清楚,目前被廣泛認可的發病假說包括單胺能神經遞質假說、神經營養因子假說、下丘腦-垂體-腎上腺軸(hypothalamic-pituitary-adrenal axis, HPA軸)假說、細胞因子假說、線粒體和氧化應激假說以及“微生物-腸-腦軸”假說等。其中細胞因子假說近些年越來越被重視,大量的研究表明炎癥與抑郁癥的發生密切相關,抑郁癥患者或者動物模型體內炎癥水平明顯升高,而抗炎藥物有助于抑郁癥的治療[10-11]。DAPT作為γ-分泌酶的抑制劑,本身具有優良的抗炎和神經保護作用,因此我們推測DAPT可能具有抗抑郁作用。為了驗證這一猜想,我們通過CSDS建立小鼠抑郁模型,觀察DAPT的抗抑郁作用。結果發現,DAPT明顯抑制CSDS誘導的小鼠社會接觸率和糖水偏愛率的降低,縮短了FST和TST中的不動時間,并且提高了小鼠的自主活動能力,這些結果表明DAPT改善了CSDS誘導的小鼠抑郁樣行為,具有抗抑郁作用。

炎癥小體是一種多蛋白復合物,在免疫炎癥反應過程中起關鍵作用。NLRP3炎癥小體是目前研究最廣泛的炎癥小體,包括感應分子NLRP3,連接蛋白ASC和效應分子pro-caspase-1。NLRP3炎癥小體激活可剪切pro-caspase-1變成caspase-1,進而促進前致炎因子pro-IL-1β和pro-IL-18的成熟和釋放,參與了腦缺血[12]、神經退行性疾病[13]、癲癇[14]等多種神經系統疾病的發生發展。最近研究表明,抑郁癥患者血清NLRP3水平是上調的,并且抑郁小鼠腦內NLRP3炎癥小體也是被激活的[15],而抑制NLRP3炎癥小體的激活具有抗抑郁作用,提示NLRP3炎癥小體在抑郁癥的病理過程中扮演重要角色。因此,為了研究DAPT的抗抑郁作用機制,我們觀察了其對NLRP3炎癥小體的影響。結果顯示,DAPT能明顯抑制CSDS誘導的小鼠海馬組織中NLRP3炎癥小體復合物(NLRP3、ASC、caspase-1)和炎癥因子TNF-α、IL-1β和IL-18表達的增加,這些表明DAPT能阻斷抑郁小鼠腦內NLRP3炎癥小體的激活及其介導的炎癥反應,提示DAPT的抗抑郁作用可能與其抑制NLRP3炎癥小體介導的炎癥反應有關。

自噬是亞細胞水平的“自我吞噬”,可通過形成自噬溶酶體降解受損的大分子和細胞器,實現細胞自身代謝和某些細胞器的更新。生理性自噬在維持細胞內穩態方面起重要作用,自噬失調則會導致細胞死亡。研究表明,自噬在衰老、免疫、腫瘤發生及神經退行性疾病[16-17]等多種生理病理過程中發揮重要作用。最近研究表明,抑郁小鼠腦內自噬水平是下調的,激活自噬能改善應激誘導的小鼠抑郁樣行為[18],提示自噬與抑郁癥發生密切相關。為進一步研究DAPT抗抑郁的作用機制,我們觀察了其對小鼠海馬自噬功能的影響,結果發現,DAPT抑制了CSDS誘導的小鼠海馬自噬相關蛋白Atg7、Atg5和Beclin1表達的降低和p62蛋白表達的升高,表明DAPT增加了抑郁小鼠海馬自噬功能,提示DAPT可能是通過提高海馬自噬功能來改善小鼠抑郁樣行為的。

綜上所述,本研究通過CSDS建立小鼠抑郁模型,探究DAPT對慢性應激誘導的小鼠抑郁樣行為的作用及其機制。結果證實DAPT能改善CSDS誘導的抑郁樣行為,其機制可能與抑制小鼠海馬組織中NLRP3炎癥小體激活以及提高自噬功能有關。我們的研究為探究抑郁癥的發生機制提供新思路,并為抑郁癥臨床藥物的開發提供新的藥物靶點。