氯化兩面針堿通過抑制p53泛素化降解誘導宮頸癌細胞凋亡的機制

石忠秀,黃 勇,趙歡歡,楊林森,劉永斌,王呈呈,李 威

(1.貴州大學醫(yī)學院,貴州 貴陽 550025;2.畢節(jié)市市場監(jiān)督管理局檢驗檢測中心,貴州 畢節(jié) 551700)

據(jù)全球癌癥數(shù)據(jù)統(tǒng)計顯示,宮頸癌是最常見的女性生殖系統(tǒng)惡性腫瘤[1]。高危型人乳頭瘤病毒(high-risk human papillomavirus,HR-HPV)感染是女性宮頸部位產(chǎn)生癌細胞的主要誘因[2],臨床診斷發(fā)現(xiàn),99%的宮頸癌患者體內(nèi)能檢測到HPV的存在[3]。近年來,HPV疫苗雖逐步普及,但接種率仍然有限,并且不適用于處于疾病高發(fā)期的45歲以上女性。因此,在許多發(fā)展中國家,宮頸癌發(fā)病率仍呈現(xiàn)上升趨勢[1]。最新統(tǒng)計數(shù)據(jù)顯示,全球每年宮頸癌新發(fā)病例高達57萬例,死亡約31.1萬例。我國宮頸癌每年新發(fā)病例高達11萬例,死亡約6萬例[1]。

在HR-HPV陽性宮頸癌細胞中,由HPV編碼的原癌蛋白E6可與UBE3A基因編碼的泛素蛋白連接酶E6AP形成復合物[4],共同介導抑癌蛋白p53的泛素化修飾,并通過26S蛋白酶體途徑使其降解[5]。由于p53蛋白被過度降解,導致其蛋白水平降低,抑癌功能受損,引起腫瘤細胞凋亡減少,增殖失控,引起宮頸癌的發(fā)生發(fā)展[6]。此外,有研究表明,宮頸癌多呈現(xiàn)E6AP活性的增高[7]。因此,通過抑制E6AP介導的泛素化降解來維持p53蛋白水平應是靶向抗癌研究的有效途徑。

氯化兩面針堿(nitidine chloride,NC)系來源于傳統(tǒng)中藥兩面針根部的苯駢菲啶類化合物[8]。NC在治療包括腫瘤在內(nèi)的多種疾病中均體現(xiàn)出較大的價值,因此受到國內(nèi)外研究人員的關(guān)注[9]。NC最初因具有止痛、消炎、抗寄生蟲、抗氧化、抗菌等藥理活性而被發(fā)現(xiàn)[10-11],隨著其抗腫瘤活性及機制的深入研究,逐漸被證實具有明顯的抑制肝癌[12]、卵巢癌[13]、前列腺癌[14]、口腔癌[15]等癌細胞增殖的作用。目前,關(guān)于NC在宮頸癌治療中的作用及機制報道較少。本研究發(fā)現(xiàn),NC可抑制E6AP與p53的相互作用,降低p53泛素化修飾水平,延緩p53降解速度,上調(diào)p53蛋白表達水平,恢復其抑癌功能,發(fā)揮抗宮頸癌作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1試劑和抗體 NC(B20783)購自上海源葉生物科技有限公司;DMEM培養(yǎng)基(10-013-CVRC)為美國CORNING公司產(chǎn)品;胎牛血清(10270106)、青霉素/鏈霉素(15070063)及胰蛋白酶(25200072)均購自美國Gibco公司;從美國Proteintech公司購得GAPDH單克隆抗體(60004-1-Ig);從美國Cell Signaling Technology公司獲得PARP(9532)、caspase-3(9662s)、caspase-8(9746s)、caspase-9(9508s)、Bax(2772s)及Bcl-2(15071s)抗體;E6AP(sc-166689)、p53(sc-126)、Ubiquitin(Ub,sc-8017)及normal mouse IgG(sc-2025)抗體來源于美國Santa cruz biotechnology公司;放線菌酮(Cycloheximide,CHX,S7418)購自美國Selleck公司;Cell Counting Kit-8(CCK-8,c0040)來自上海Beyotime Biotechnology公司;從南京Vazyme公司購得TUNEL FITC Apoptosis Detection Kit(A111-03);Protease Inhibitor Cocktail(K1007)來自美國APExBIO公司。

1.1.2細胞系與細胞培養(yǎng) 人宮頸癌HeLa及SiHa細胞系均來源于中國科學院上海生命科學研究院細胞資源中心。細胞培養(yǎng)基使用添加了10%胎牛血清及1%青霉素/鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基,將細胞置于培養(yǎng)條件為37 ℃和5% CO2的培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)。

1.2 方法

1.2.1CCK-8實驗通過CCK-8實驗測定NC對HeLa及SiHa細胞的毒性作用。將細胞接種于96孔板中,密度為3×107cells/L,每孔100 μL細胞懸液。次日,細胞貼壁后去除上清,并向培養(yǎng)板中加入含一定濃度NC的培養(yǎng)基,在37 ℃下孵育12 h、24 h或48 h。隨后加入CCK-8溶液,繼續(xù)孵育1 h后,使用酶標儀(Bio-Rad Laboratories, CA, USA)在波長450 nm處檢測吸光度值。用藥物處理組與對照組的活細胞百分比值表示細胞存活率,其計算公式為:細胞存活率/%=(A處理組-A空白組)/A對照組-A空白組)×100 %。

1.2.2克隆形成實驗 采用克隆形成實驗探究NC對HeLa和SiHa細胞的生長抑制作用。細胞以1×106cells/L的密度接種于6孔細胞培養(yǎng)板中,每孔1 mL細胞懸液。待細胞貼壁后,加入含NC的培養(yǎng)基,處理細胞12 h,去除含藥培養(yǎng)基,加入新鮮培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。每2～3 d更換一次培養(yǎng)基,持續(xù)培養(yǎng)14 d。每天觀察細胞生長狀態(tài),當對照組的細胞集落數(shù)量≥100時,去除培養(yǎng)基,并用PBS輕柔洗滌細胞2次。使用4%的多聚甲醛固定細胞,每孔1 mL。于室溫靜置15 min后,吸去多聚甲醛,并用PBS小心洗滌細胞2次,每次靜置5 min。每孔加入1 mL 5%的結(jié)晶紫染色液,于室溫下靜置染色15 min。吸去染液,并用蒸餾水洗去多余染液,洗滌3～5次,觀察并記錄各組細胞克隆數(shù)。

1.2.3TUNEL分析 重懸細胞后,將細胞密度調(diào)整為1×108L-1,向共聚焦培養(yǎng)皿中加入細胞懸液,每皿1 mL。待細胞貼壁后,用含NC的培養(yǎng)基處理細胞12 h。隨后,根據(jù)試劑盒說明書操作步驟進行TUNEL分析,并使用激光共聚焦顯微鏡(Olympus Corporation)進行觀察并拍照。

1.2.4Western blot分析 蛋白質(zhì)樣品經(jīng)SDS-PAGE電泳分離,并轉(zhuǎn)移至PVDF膜(美國Millipore公司)上。使用5 %的脫脂牛奶于室溫下封閉PVDF膜1 h。后將其用一抗孵育2 h,再用二抗孵育1 h。使用化學發(fā)光系統(tǒng)(上海天能科技有限公司)檢測蛋白表達水平。

1.2.5免疫共沉淀實驗 細胞經(jīng)含藥培養(yǎng)基和對應溶劑處理12 h后,將其浸入含Protease Inhibitor Cocktail的IP裂解液中,4 ℃條件下裂解細胞15 min。將細胞輕輕刮下,收集于1.5 mL微量離心管中,將離心管置于冰上,使用超聲破碎儀進行細胞破碎,隨后使用冷凍離心機于4 ℃條件下離心10 min,轉(zhuǎn)速為14 000 r·min-1。加入p53抗體,將樣本置于4 ℃下慢速旋轉(zhuǎn),孵育過夜。加入protein G agarose繼續(xù)慢速旋轉(zhuǎn)6～8 h,隨后洗滌3次。使用SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液制備蛋白樣品,并置于金屬浴中,95 ℃加熱10 min,最后進行Western blot分析。

1.2.6泛素化實驗 細胞經(jīng)含藥培養(yǎng)基和對應溶劑處理12 h后,將其浸入含Protease Inhibitor Cocktail的RIPA裂解液中,4 ℃條件下裂解細胞15 min。將細胞集于1.5 mL微量離心管中,使用超聲破碎儀于低溫下進行細胞破碎,隨后使用冷凍離心機于4 ℃條件下離心10 min,轉(zhuǎn)速為14 000 r·min-1。加入p53抗體,并在4 ℃環(huán)境下低速旋轉(zhuǎn)孵育過夜,加入protein G agarose繼續(xù)慢速旋轉(zhuǎn)6～8 h,隨后洗滌3次。使用SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液制備蛋白樣品,并置于金屬浴中,95 ℃加熱10 min,最后進行Western blot分析。

1.2.7蛋白穩(wěn)定性實驗 細胞經(jīng)含有NC的培養(yǎng)基處理12 h,棄去含藥培養(yǎng)基,加入120 mg·L-1CHX溶液,分別處理細胞0 、15、30、45、60 min后收集樣本,提取各組細胞總蛋白,隨后進行Western blot分析。

Fig 2 Apoptosis of cervical cancer cells induced by

2 結(jié)果

2.1 NC對宮頸癌細胞的生長抑制作用以HeLa(HPV 18陽性)和SiHa(HPV 16陽性)細胞為對象,分別用不同濃度的NC處理細胞12、24或48 h,采用CCK-8法檢測NC的細胞毒性作用并計算半數(shù)抑制濃度(inhibitory concentration 50,IC50)值。結(jié)果顯示,NC可呈劑量依賴地發(fā)揮對HeLa和SiHa細胞的毒性作用,且隨作用時間延長,IC50值逐漸降低(Fig 1A)。NC在HeLa細胞中作用12、24、48 h時,IC50值分別為(8.86±0.52)、(3.58±0.06)、(1.97±0.034) μmol·L-1;在SiHa細胞作用12、24、48 h時,IC50值分別為(8.50±0.26)、(4.42±0.065)、(1.67±0.07) μmol·L-1。

為進一步驗證NC對宮頸癌細胞增殖的抑制活性,采用克隆形成實驗探究了NC對HeLa和SiHa細胞的生長抑制作用。結(jié)果顯示,細胞經(jīng)NC處理后,其克隆數(shù)量明顯減少(P<0.01),且這種抑制作用隨NC劑量的增加而明顯加強,具有較好的劑量依賴關(guān)系(Fig 1B)。以上結(jié)果表明,NC可抑制HR-HPV陽性宮頸癌細胞增殖,表現(xiàn)出明顯的抗腫瘤作用。

2.2 NC對宮頸癌細胞凋亡的誘導作用為確定NC是否通過凋亡途徑發(fā)揮抗宮頸癌作用,本研究采用 TUNEL法檢測了NC對宮頸癌細胞凋亡的影響。結(jié)果表明,經(jīng)NC處理的細胞,TUNEL-FITC陽性比例較對照組明顯增大,即凋亡細胞增多,說明NC可誘導宮頸癌細胞凋亡(Fig 2)。此外,為進一步明確NC對宮頸癌細胞的凋亡誘導作用及細胞凋亡途徑,本研究使用Western blot法檢測了兩種宮頸癌細胞中凋亡相關(guān)蛋白的表達水平。如Fig 3所示,與對照組相比,NC處理組caspase-3、caspase-8、caspase-9及PARP蛋白的全長形式明顯減少,切割形式明顯增加。Bcl-2家族成員Bax及Bcl-2參與細胞凋亡調(diào)控,其中Bax是促凋亡蛋白,而Bcl-2則是抗凋亡蛋白。本研究發(fā)現(xiàn),NC可明顯升高Bax/Bcl-2的比值(Fig 3)。以上結(jié)果表明,NC可誘導促凋亡蛋白表達,抑制抗凋亡蛋白表達,通過內(nèi)源性和外源性兩條凋亡相關(guān)通路,介導HR-HPV陽性宮頸癌細胞發(fā)生凋亡。

Fig 3 Effect of NC on apoptosis-related protein in cervical cancer

Fig 4 NC inhibited E6AP expression and interactions between E6AP and

2.3 NC對E6AP與p53蛋白相互作用的影響為進一步探究NC對宮頸癌細胞抑制作用的具體機制,本研究對NC作用下HeLa及SiHa細胞中E6AP蛋白表達水平進行了檢測。結(jié)果如Fig 4A 所示,NC可明顯降低EA6P的蛋白水平。HR-HPV陽性宮頸癌細胞中,E6AP與HPV編碼的原癌蛋白E6結(jié)合,形成E6/E6AP異源二聚體,并與p53相互作用,從而介導p53蛋白泛素化降解,已被證實是宮頸癌發(fā)生、發(fā)展的關(guān)鍵機制。為探究NC對E6AP與p53的相互作用情況的影響,本研究采用免疫共沉淀實驗,通過免疫沉淀p53蛋白,檢測與之共同沉淀的E6AP蛋白水平。結(jié)果顯示,NC明顯降低了HeLa和SiHa細胞中與p53結(jié)合的E6AP蛋白水平(Fig 4B)。此外,經(jīng)NC處理后,與E6AP相結(jié)合的p53蛋白水平同樣下調(diào)(Fig 4C),以上結(jié)果表明,NC阻礙了E6AP與p53結(jié)合,抑制二者的相互作用。

2.4 NC對p53蛋白泛素化修飾水平的影響基于在HR-HPV陽性宮頸癌細胞中,E6AP與p53相互作用,介導其泛素化修飾,而NC可下調(diào)E6AP 蛋白表達水平,并且抑制其與p53相互作用。因此,本研究進一步檢測了經(jīng)NC處理后,細胞中p53蛋白的泛素化修飾水平。結(jié)果顯示,NC明顯抑制了HeLa和SiHa細胞中p53蛋白的泛素化修飾水平(Fig 5)。

Fig 5 Effect of NC on ubiquitination of p53 in cervical cancer

2.5 NC對p53蛋白穩(wěn)定性及蛋白表達水平的影響在HR-HPV陽性宮頸癌中,p53多為野生型,但由于E6AP介導其泛素化修飾,導致p53蛋白的過度降解,使p53蛋白表達水平降低,進而抑制其發(fā)揮抗癌功能。那么,NC對p53泛素化修飾的抑制作用最終應表現(xiàn)為促進p53蛋白穩(wěn)定性,延緩其降解,增加其蛋白水平的作用。因此,本研究進一步探究了NC是否可減緩HeLa及SiHa細胞中p53蛋白的降解速度。CHX是一種應用廣泛的蛋白合成抑制劑,可阻斷細胞蛋白質(zhì)合成,通過CHX阻斷細胞內(nèi)p53蛋白合成后,采用Western blot法檢測各組細胞中p53蛋白的降解情況。結(jié)果顯示,在HeLa和SiHa細胞中,經(jīng)NC處理后,p53蛋白降解速度較對照組明顯減慢(Fig 6A)。這表明NC可促進p53穩(wěn)定,延緩其降解。此外,本研究進一步檢測了NC作用后,HeLa和SiHa細胞細胞中p53蛋白表達情況。結(jié)果顯示,NC處理組p53蛋白表達水平明顯上調(diào)(Fig 6B)。這也與NC對p53下游蛋白Bax及Bcl-2的調(diào)控作用趨勢相一致。上述結(jié)果表明,NC可抑制HR-HPV陽性宮頸癌細胞HeLa及SiHa中E6AP介導的p53蛋白泛素化修飾,延緩其降解,促進其穩(wěn)定,從而增加其蛋白表達水平。

3 討論

宮頸癌是一種高發(fā)病率、高死亡率的女性惡性腫瘤,且患病人數(shù)仍呈現(xiàn)逐年增長的趨勢。盡管HPV疫苗的研發(fā)和使用及宮頸癌篩查均取得較大進展,但已感染者和未被疫苗有效覆蓋的人群仍面臨著巨大風險。目前,手術(shù)、放療及化療是臨床治療中的標準診療方案,但存在創(chuàng)傷大、易復發(fā)或轉(zhuǎn)移、易發(fā)生耐藥等缺點。因此,急需開發(fā)對宮頸癌針對性強、療效好、毒副作用小的靶向藥物。

腫瘤的發(fā)生與細胞信號傳導、激素調(diào)節(jié)及轉(zhuǎn)錄調(diào)控的失調(diào)密切相關(guān)。此外,原癌基因和抑癌基因發(fā)生功能性突變也是導致腫瘤形成的重要原因。這些失調(diào)與突變會導致DNA復制失控,端粒酶發(fā)揮作用,進而引起細胞惡性增殖,促進腫瘤發(fā)生。TP53作為最重要的抑癌基因之一,其結(jié)構(gòu)突變及功能缺失是許多腫瘤發(fā)生、發(fā)展的重要原因。由TP53基因編碼的p53蛋白是一種抑癌蛋白,參與了包括DNA修復、細胞凋亡及細胞周期阻滯等重要生命活動[16]。p53分為野生型和突變型,在p53野生型的腫瘤細胞中,其主要通過小鼠雙微體2(murine double minute 2,MDM2)所介導的泛素蛋白酶體途徑(ubiquitin proteasome pathway,UPS)進行降解。然而,在HR-HPV陽性的宮頸癌細胞中,MDM2功能受到抑制,E6AP與E6蛋白形成異源二聚體,進一步募集p53,與之形成復合物,并通過UPS促使p53降解[16]。因此,尋找可阻斷E6AP所介導的p53泛素化降解的藥物對宮頸癌的治療具有重要意義。

Fig 6 NC promoted stability of p53 protein in cervical cancer

NC是一種從兩面針根部提取得到的具有明確生物活性的芐基四氫異喹啉類化合物,是兩面針中研究最為深入和廣泛的生物堿之一。據(jù)報道,NC對多種腫瘤均有明顯的抑制作用。已被報道的抗腫瘤作用機制有:抑制細胞周期相關(guān)蛋白表達,誘導細胞周期阻滯。NC還可通過調(diào)控JAK/STAT3、PI3K/AKT/mTOR等經(jīng)典信號通路及線粒體途徑,從而發(fā)揮誘導細胞凋亡的作用[17]。此外,NC可調(diào)控蛋白激酶信號通路,進而抑制腫瘤細胞的侵襲、轉(zhuǎn)移。值得注意的是,NC可通過上調(diào)p53蛋白表達,并激活其下游信號通路發(fā)揮抗腫瘤活性[18]。然而,NC究竟是通過增多p53合成還是抑制p53降解發(fā)揮上調(diào)p53蛋白水平的作用目前尚不清楚。此外,目前關(guān)于NC的抗宮頸癌作用及具體機制報道較少。

本研究通過CCK-8及克隆形成實驗發(fā)現(xiàn)傳統(tǒng)中藥兩面針的活性成分NC對HR-HPV陽性宮頸癌細胞具有明顯的毒性作用,可呈時間和劑量依賴性抑制HR-HPV陽性宮頸癌細胞增殖(Fig 1)。此外,TUNEL實驗結(jié)果表明,經(jīng)NC處理后,宮頸癌細胞凋亡水平增加(Fig 2)。通過檢測凋亡相關(guān)蛋白表達情況,結(jié)果與TUNEL實驗結(jié)果一致,NC可明顯誘導HR-HPV陽性宮頸癌細胞凋亡的發(fā)生(Fig 3)。上述結(jié)果均表明,NC具有抗HR-HPV陽性宮頸癌的作用。

在HR-HPV陽性宮頸癌細胞中,p53蛋白泛素化降解主要由泛素蛋白連接酶E6AP所介導,且在細胞中E6AP蛋白表達水平異常升高。本研究發(fā)現(xiàn),NC可明顯抑制宮頸癌細胞中E6AP蛋白表達(Fig 4A)。E6AP與p53相互作用,通過泛素化途徑致其降解,導致其抑癌功能受到抑制。免疫共沉淀實驗結(jié)果表明,NC可抑制E6AP與p53相互作用(Fig 4B-C)。同時,泛素化實驗結(jié)果顯示,NC可降低p53蛋白泛素化修飾水平,且該抑制作用具有較好的劑量依賴性(Fig 5)。綜上結(jié)果,NC可抑制E6AP蛋白表達,降低與p53結(jié)合的E6AP蛋白水平,進而降低p53泛素化修飾水平。為進一步確定NC是否可抑制p53的降解,恢復p53蛋白水平,本研究檢測了NC對p53蛋白降解速度及表達水平的影響。蛋白穩(wěn)定性實驗和Western blot實驗結(jié)果顯示,NC處理后,兩種宮頸癌細胞中p53蛋白的降解速度明顯減慢(Fig 6A),p53蛋白表達水平明顯升高(Fig 6B)。

綜上所述,本研究首次發(fā)現(xiàn)并證實了NC可抑制宮頸癌細胞E6AP蛋白表達,并抑制其與p53相互作用,削弱其介導的p53蛋白泛素化修飾程度,抑制p53蛋白降解,增加p53蛋白表達水平,從而恢復p53蛋白的抑癌功能,發(fā)揮明顯的抗宮頸癌作用。這可為進一步探索NC用于宮頸癌治療提供實驗基礎和理論依據(jù),對其臨床應用具有參考價值。