減毒沙門菌SGN1對鼻咽癌的抑制作用及機制研究

賴運浩,譚綺婷,黃庭祺,劉 石,彭月榮,李芳紅,趙正剛,周素瑾,麥家洛,趙子建

(1. 廣東工業大學生物醫藥學院,廣東 廣州 510006;2. 北京理工大學珠海學院材料與環境學院 廣東 珠海 519085;3. 廣州華津醫藥科技有限公司, 廣東 廣州 510700)

鼻咽癌是一種高發于中國南部以及一些東南亞地區,在世界其他地區卻罕見的癌癥[1]。鼻咽癌發生率男性高于女性[2]。EB病毒(Epstein-Barr virus,EBV)感染和環境以及遺傳因素是鼻咽癌發生的主要原因[3]。目前鼻咽癌主要治療技術手段是進行常規化療或者放療,但治療效果有限,30%～40%病人治療4年后復發且發生遠處轉移,且對放射治療不敏感[4-6]。因此尋找一種治療有效減少復發的手段具有重要意義。

溶瘤細菌療法是目前極具創新療法,靶向性高,定植腫瘤微環境[7]。細菌可以通過基因工程改造編碼和通過局部遞送有效載荷,包括小分子、毒素、免疫調節劑、前藥物轉化酶,小干擾RNA和納米體等[8]。已有臨床試驗證明VNP20009的安全性[9],但其有效性有待研究。由廣州華津醫藥科技有限公司自主研發SGN1利用VNP20009靶向性以及絕大多數腫瘤細胞具有甲硫氨酸依賴性特點進行基因工程改造獲得高表達甲硫氨酸酶減毒沙門菌SGN1,甲硫氨酸酶可分解甲硫氨酸為甲硫醇、α-酮丁酸和氨,進一步降低腫瘤細胞內甲硫氨酸水平[10]。前期已有研究在其他腫瘤如乳腺癌中有良好治療效果,且副作用低[11],但鼻咽癌對甲硫氨酸限制的敏感性以及高表達甲硫氨酸酶減毒沙門菌SGN1在鼻咽癌上的治療作用仍有待進一步研究。本研究通過甲硫氨酸限制培養以及利用減毒沙門菌SGN1研究對鼻咽癌的治療作用及機制,為后期臨床治療奠定理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1菌種與細胞株 SGN1、VNP20009-V(VNP-V)均來自廣州華津醫藥科技有限公司。人源鼻咽癌細胞HNE細胞、5-8F細胞和CNE-2細胞,由中南大學研究中心贈予。

1.1.2實驗動物 4～5周齡的♂BALB/c-nude裸鼠鼠購自廣東藥康生物科技有限公司,飼養于廣東藥科大學實驗動物中心,實驗倫理嚴格遵循廣東藥科大學動物護理委員會規定(批號:GOPUSPF2017048)。

1.1.3試劑與儀器 普通RPMI 1640培養基(含甲硫氨酸, 貨號11875119)、不含甲硫氨酸的RPMI 1640(貨號A14517-01)培養基購自Gibco公司;L-甲硫氨酸(L-Methionine, Met, 貨號M5308)、L-同型半胱氨酸(L-Homocysteine, Hcy, 貨號H9633)、硫酸卡那霉素(E00400)購自Sigma公司;青霉素和鏈霉素(貨號15140-122)購自賽默飛公司;胎牛血清(FBS, 貨號Z7185FBS)購自Zeta公司;胰蛋白胨(貨號VG0300)、酵母提取物(貨號LP0021B)購置賽默飛公司;PBS片劑(磷酸緩沖鹽溶液, 貨號B640435)、硫酸慶大霉素(貨號A506614)、CCK-8試劑盒(貨號E606335)購自上海生工生物公司;氯化鈣(貨號1.02378)、硫酸鎂(貨號1.05886)購自德國默克公司;BCA蛋白定量試劑盒(貨號23235)購自賽默飛公司、ECL發光液(貨號E412-01-AA)購自南京諾維贊公司;Bcl-2(貨號D55G8)、GADPH(貨號2118S)抗體購自CST公司;HPR標記的山羊抗兔二抗(貨號A21245)購自賽默飛公司;細胞周期與細胞凋亡檢測試劑盒(貨號C1052)上海碧云天生物技術有限公司;APC Annexin-V/PI凋亡檢測試劑盒(貨號640932)購自Biolegend公司。AC2-4S1型二級生物安全柜購自ESCO公司;TDZ5-WS型多管架自動平衡離心機購自大龍興創實驗儀器(北京)有限公司;流式細胞儀購自美國貝克曼公司;ChemiDoc+XRS化學發光凝膠成像系統美國伯樂公司;倒置顯微鏡購自德國尼康公司;酶標儀購自美國BioTek公司。

1.2 方法

1.2.1細胞培養 人源鼻咽癌細胞培養采用1%雙抗(含100 mg·L-1鏈霉素和100 kU·L-1青霉素)以及10%胎牛血清的RPMI 1640培養基,放置于37 ℃、5% CO2培養箱中進行培養,每隔2～3 d進行傳代1次。所有細胞實驗均取處于對數生長期的細胞進行研究。

1.2.2細胞計數檢測細胞生長曲線 取人鼻咽癌細胞接種于6孔板,分為con、Met-Hcy+、Met-Hcy-(con:對照組含終濃度為200 μmol·L-1甲硫氨酸不含同型半胱氨酸RPMI 1640完全培養基;Met-Hcy+:含終濃度為200 μmol·L-1同型半胱氨酸不含甲硫氨酸RPMI 1640完全培養基;Met-Hcy-:既不含甲硫氨酸也不含同型半胱氨酸RPMI 1640完全培養基)。各組放置于37 ℃、5% CO2培養箱中進行2、4、6 d進行培養。取相應時間點進行消化并且用血細胞計數板進行計數和統計。

1.2.3細胞平板克隆 每組細胞以每孔3000個細胞分別接種于6孔板中,分成con組和met-組(met-為RPMI 1640完全培養基不含甲硫氨酸組別),貼壁后con組為含甲硫氨酸的1640完全培養基,met-改為不含甲硫氨酸RPMI 1640完全培養基,每隔3 d進行換液,培養21 d;吸除上清液用PBS清洗2次,添加1 mL甲醇固定15 min;用2%結晶紫染液染色15 min,直接用肉眼計數形成細胞克隆數并進行統計。

1.2.4細胞劃痕實驗 取對數生長期細胞消化重懸種板,每孔添加4×105個細胞過夜培養,當細胞長滿整個孔進行劃痕,劃痕完成后用1 mL PBS洗2次將劃痕時漂浮起來的細胞洗去,分為對照組con和實驗組met-,然后根據組別加入完全培養基和完全培養基甲硫氨酸缺陷培養基。在0 h、24 h在劃痕同一位置進行拍照取樣,通過觀察劃痕面積的變化情況對細胞的遷移性能進行檢測。

1.2.5流式細胞術檢測細胞周期 取對數生長期的細胞,細胞數為5×105/皿,實驗組met-用甲硫氨酸缺陷培養基處理48 h或4 d,用胰酶消化輕微吹打成單細胞懸液,1 000×g離心5 min用PBS清洗2遍。離心去上清,各加入1 mL預冷70%乙醇固定24 h。固定后離心去上清,加入PI染液37 ℃避光溫育30 min,用流式細胞儀檢測各組細胞周期情況。

1.2.6流式細胞術檢測細胞凋亡 用甲硫氨酸缺陷培養基提前種板分為對照組con和實驗組met-,對照組按照1 ∶1 000的比例加入甲硫氨酸(200 mmol·L-1),而實驗組則進行甲硫氨酸缺陷培養。培養4 d后進行消化處理,后將細胞懸液離心2分鐘棄去上清,加入1 mL PBS進行吹打混勻;再離心2分鐘棄去上清;接著添加100 μL Binding Buffer吹打混勻進行緩沖,再加5 μL APC Annexin V混勻;后再加10 μL PI染液充分混勻進行染色,避光靜置15分鐘;靜置結束后再加入400 μL的Binding Buffer,混勻后使用流式細胞術法進行細胞凋亡檢測。

1.2.7蛋白免疫印跡檢測凋亡蛋白表達 使用RIPA強裂解液對各組蛋白進行提取,用BCA試劑盒對蛋白濃度進行測定并用5 × SDS進行95 ℃變性。經過電泳、轉膜、封閉,按1 ∶1 000稀釋一抗,然后4 ℃孵育過夜,用二抗(1 ∶5 000)室溫孵育1 h后,用化學發光成像儀進行曝光,用Image Lab分析條帶灰度。

1.2.8細菌細胞共培養實驗 分別劃線接種VNP-V和SGN1于5 mL改良型LB液體培養基(含50 mg·L-1卡那霉素)過夜培養,取過夜培養液以1 ∶100轉接于改良型LB液體培養基8000 ×g離心5 min去除培養基,生理鹽水重懸離心重復3次,離心生理鹽水重懸后調節濃度為1×1012cfu·L-1,根據不同需求用于后續菌胞共培養。每組以1.0×105個細胞每孔分別接種于6孔板中,貼壁后,根據細胞細菌比例1 ∶100分別加入VNP-V和SGN1共培養5 h后,用慶大霉素進行滅活24 h進行用CCK8進行檢測細胞增殖,而細胞凋亡情況通過流式細胞術進行檢測。

1.2.9裸鼠皮下構建5-8F異種腫瘤模型 制備5-8F細胞懸液濃度為每毫升0.5×107細胞,取200 μL注射于裸鼠右腋下,待皮下腫瘤約80～100 mm3分成3組con、VNP-V、SGN1,每組3只分別進行瘤內給藥,對照組瘤內注射20 μL生理鹽水,而VNP-V組和SGN1組分別注射2×105cfu/只。每隔3 d使用游標卡尺量取腫瘤體積[腫瘤體積(mm3)=0.52×長(mm)×寬2(mm2)]和稱取小鼠體質量,繪制腫瘤生長曲線。

2 結果

2.1 人源鼻咽癌細胞HNE-2、5-8F和CNE-2具有甲硫氨酸依賴性為了證明人源鼻咽癌細胞對甲硫氨酸具有依賴性,在甲硫氨酸缺陷的培養條件下對鼻咽癌細胞5-8F、HNE-2、CNE-2進行培養,分別在第0、2、4、6天對細胞進行計數,發現對照組的5-8F、HNE-2、CNE-2細胞正常生長,而甲硫氨酸缺陷組生長受到顯著抑制即使補充同型半胱氨酸組(P<0.01),5-8F、HNE-2、CNE-2細胞生長仍然受到抑制(Fig 1A-C),以上結果提示,人源鼻咽癌細胞HNE-2、5-8F和CNE-2具有甲硫氨酸依賴性。

Fig 1 Nasopharyngeal carcinoma cells depended on methionine

2.2 甲硫氨酸限制抑制鼻咽癌細胞的克隆形成能力和遷移能力為進一步探討甲硫氨酸限制對鼻咽癌細胞5-8F、HNE-2的增殖和遷移能力的影響,通過平板克隆實驗結果發現,甲硫氨酸缺陷培養的實驗組鼻咽癌細胞單克隆形成能力相對對照組顯著受到了抑制,具有統計學差異(Fig 2A,B,P<0.01)。此外,同時進行劃痕實驗,通過劃痕面積的改變來檢測細胞的遷移能力。根據實驗結果顯示(Fig 2C),劃痕后24 h,甲硫氨酸缺陷培養組的細胞劃痕傷口愈合受到抑制。以上結果表明甲硫氨酸缺陷對鼻咽癌細胞HNE-2、CNE-2的遷移有抑制作用。

2.3 甲硫氨酸限制促進鼻咽癌細胞凋亡和周期阻滯為了探索甲硫氨酸缺陷對鼻咽癌細胞的凋亡和細胞周期作用,用流式細胞術檢測甲硫氨酸缺陷后對鼻咽癌細胞的凋亡和周期的變化。首先用PI檢測甲硫氨酸缺陷對鼻咽癌細胞CNE-2周期的變化情況,結果表明,甲硫氨酸缺陷阻滯鼻咽癌細胞周期在G2/M期(Fig 3A,B)。然后進一步用PI/Annexin-V染料檢測在甲硫氨酸缺陷培養條件下鼻咽癌凋亡情況,結果表明,甲硫氨酸缺陷促進鼻咽癌細胞凋亡(Fig 3C,D),且具有統計學差異(P<0.01)。進一步檢測細胞凋亡蛋白情況,通過Western blot檢測抗凋亡蛋白Bcl-2,結果發現甲硫氨酸剝奪明顯下調鼻咽癌細胞Bcl-2的表達(Fig 3E-G),從而促進鼻咽癌細胞凋亡。

2.4 SGN1誘導鼻咽癌細胞發生凋亡前期研究減毒沙門細菌SGN1可表達甲硫氨酸酶從而降低腫瘤細胞內甲硫氨酸[10],因此進一步驗證SGN1對人源鼻咽癌細胞生長抑制作用,首先將鼻咽癌細胞5-8F、HNE-2、CNE-2與SGN1以共培養比例(1 ∶100)進行菌胞共培養5 h,結果發現SGN1抑制人鼻咽癌細胞5-8F、HNE-2和CNE-2細胞增殖(Fig 4A),并且通過PI/Annexin-V染色流式細胞術檢測發現,SGN1促進鼻咽癌細胞的凋亡(Fig 4B,C),且較對照組具有統計學差異。

Fig 2 Effect of methionine deprivation on monoclonal formation and migration of nasopharyngeal carcinoma cells(n=3)

2.5 SGN1抑制鼻咽癌異種移植瘤生長為了進一步觀察SGN1在體內的效果,我們通過構建鼻咽癌皮下異種移植瘤(5-8F)模型,通過瘤內給予藥物后,觀察裸鼠的活動、進食無明顯差別,體質量呈穩定趨勢。與對照組、VNP-V相比,SGN1顯著抑制腫瘤生長,且瘤重明顯低于對照組(P<0.05)和VNP-V組(P<0.01)(Fig 5C,D),而VNP-V相對對照組組無明顯差異(Fig 5 B),說明SGN1可抑制鼻咽癌異種移植瘤的生長。

3 討論

鼻咽癌是一種復雜多因素疾病,且疾病發生發展速度快,目前治療藥物有限,因此尋找一種治療有效減少副作用的藥物具有重要意義。甲硫氨酸是人體必須氨基酸,參與DNA、蛋白質等重要物質的合成,而腫瘤普遍具有甲硫氨酸依賴性,剝奪甲硫氨酸能夠特異的抑制腫瘤細胞的生長[12]。而且前期研究主要關注限制甲硫氨酸飲食和注射重組甲硫氨酸酶療法,盡管這兩種限制甲硫氨酸的方法有一定抑制腫瘤的作用,但同時也伴有較為嚴重的副作用,如導致患者體重減輕、引起機體免疫反應等[13-14]。而細菌作為靶向載體表達作用分子,具有用于治療腫瘤潛在的臨床價值。SGN1具有VNP20009靶向性及安全性和可分解腫瘤細胞內甲硫氨酸特性,能特異的與腫瘤競爭甲硫氨酸,前期研究已在骨肉瘤、乳腺癌取得顯著的藥效作用[15],在本研究經甲硫氨酸限制處理人鼻咽癌細胞生長速度減慢,克隆形成率下降以及遷移。以上結果表明,SGN1可限制腫瘤甲硫氨酸,發揮抑制人鼻咽癌細胞生長的作用。

甲硫氨酸限制影響S-腺苷甲硫氨酸(S-adenosyl-l-methionine,SAM)合成減少,從而降低甲基化進而造成代謝缺陷,導致細胞周期阻滯進而促進細胞發生凋亡。甲硫氨酸依賴性腫瘤細胞中的甲硫氨酸減少可導致細胞周期停滯在S/G2期,而停滯在S/G2期細胞易發生自發性死亡并對化療藥物更加敏感[16]。本研究通過剝奪腫瘤細胞甲硫氨酸使腫瘤細胞細胞周期阻滯在G2/M期。G2期檢查點能防止受損DNA和未完成復制DNA進入有絲分裂,而鼻咽癌細胞DNA復制在G2/M期受阻,導致腫瘤細胞不能完成DNA復制進一步阻斷細胞有絲分裂,從而可能誘導細胞發生凋亡。細胞凋亡是細胞程序性死亡的一種方式,由多基因控制此過程,如Bcl-2、caspase家族等[17]。通過甲硫氨酸缺陷處理人鼻咽癌細胞,流式細胞術檢測發現甲硫氨酸缺陷處理后人鼻咽癌細胞凋亡率增加,并且Western blot結果顯示下調抗凋亡蛋白Bcl-2,以上結果表明甲硫氨酸剝奪可促進鼻咽癌細胞發生凋亡,因此通過剝奪腫瘤細胞甲硫氨酸抑制腫瘤生長是可行有效的。

Fig 3 Effect of methionine deprivation on cell cycle and apoptosis in nasopharyngeal carcinoma cells(n=3)

Fig 4 SGN1 inhibited proliferation and induced apoptosis in nasopharyngeal carcinoma cells(n=3)

Fig 5 SGN1 inhibited nasopharyngeal carcinoma 5-8F subcutaneous xenograft tumor growth(n=3)

細菌的天然靶向性可作為介導載體用于抗腫瘤治療,減毒沙門菌SGN1以VNP20009為載體表達甲硫氨酸酶,甲硫氨酸酶可分解腫瘤內甲硫氨酸,可解決重組甲硫氨酸酶容易被人體代謝的問題。本研究首先通過SGN1與鼻咽癌細胞進行共培養,發現減毒沙門菌SGN1抑制鼻咽癌細胞增殖并誘導腫瘤細胞發生凋亡,體內實驗結果表明,SGN1顯著抑制鼻咽癌5-8F皮下抑制瘤的生長,而小鼠體質量則不受影響。說明減毒沙門菌SGN1可作為鼻咽癌潛在治療藥物,但SGN1是通過哪些信號分子誘導腫瘤細胞凋亡以及在患者體內激活免疫功能協助如何抗腫瘤機制還需進一步研究。

綜上所述,高表達甲硫氨酸酶減毒沙門菌SGN1顯著抑制人鼻咽癌細胞的增殖,可能通過阻滯細胞周期G2/M期誘導細胞凋亡,從而抑制鼻咽癌細胞的生長。因此利用沙門菌靶向表達甲硫氨酸酶用于治療鼻咽癌具有臨床潛在價值,同時也為SGN1在臨床治療鼻咽癌提供藥理研究基礎。