漢黃芩素調控TLR4/MAPK/NF-κB信號通路對糖尿病腎病大鼠腎纖維化的影響

張旭東,任桂靈,陳慧慧,陳 紜,朱 捷

(1. 中國人民解放軍聯勤保障部隊第九〇一醫院藥劑科,安徽 合肥 230031;2. 安徽醫科大學藥學院,安徽 合肥 230032)

糖尿病是近年來常見的代謝性疾病,會引發一系列糖尿病并發癥如糖尿病腎病 (diabetic nephropathy, DN),DN是一種嚴重的微血管糖尿病并發癥,以尿蛋白為主要臨床表現,也是終末期腎臟疾病常見的繼發原因[1]。 DN的發病機制及其復雜性可能與高血糖、脂代謝障礙、腎小球血流動力學、炎癥反應和纖維化的發生有關[2]。大量臨床和基礎實驗表明,持續的炎癥反應在 DN 中起著至關重要的作用[3]。高血糖可刺激腎小球內皮細胞及細胞分泌炎癥因子如 IL-6、MCP-1 等,國外的相關研究報道可以通過減少 NLRP3/ASC 炎癥小體來預防小鼠2型糖尿病和1型糖尿病的炎癥和腎損傷[4]。同時,也有研究顯示,黃酮類化合物二氫槲皮素(dihydroquercetin)通過抑制活性氧 (ROS) 和腎組織中的 NLRP3 炎癥小體可以對高脂飲食(HFD)/ streprozozo催產素(STZ)注射誘導的DN模型大鼠的腎臟起到明顯的保護作用[5]。除此之外,還有報道表明,外源性硫化氫通過抑制H9c2心臟細胞中Toll樣受體4 (TLR4)/核因子(NF)-κB信號通路及其下游NLRP3炎癥小體的激活來減弱高糖誘導的心肌細胞炎癥[6]。TLR4是一種刺激包括MAPK和NF-κB通路在內的幾種下游通路的受體,是NLRP3炎性小體通路的關鍵調節因子,NF-κB能夠促進NLRP3等促炎細胞因子的合成,因此,NF-κB和絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)信號通路的激活,參與了炎癥和纖維化反應[7]。由此我們進一步推測,在DN模型中,通過靶向TLR4/MAPK/NF-κB信號通路抑制NLRP3炎性小體的激活,是否可以對DN大鼠抗腎纖維化產生有效的保護作用。

近年研究發現,許多中藥和中成藥,包括芍藥總苷、黃芪總皂苷等,可以通過抑制一些信號通路如JAK/STAT的激活,降低下游炎癥因子和纖維化因子的表達,進而緩解DN的發生和發展。漢黃芩素是植物黃芩的主要藥用成分之一,具有抗炎和抗氧化等多種藥理作用,一直被廣泛應用于腫瘤、炎癥等多種疾病治療研究[8]。漢黃芩素是從植物黃芩中分離出來的活性成分,具有抗炎和抗氧化等多種活性,已有研究證實了其保護肝臟的作用。漢黃芩素在體外具有促進間充質干細胞向功能肝細胞分化的作用,并為體內CCl4誘導的肝纖維化提供有效的治療。本研究旨在探究漢黃芩素對DN大鼠腎纖維化損傷是否具有治療作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1實驗動物 健康成年SD、SPF級大鼠,(200～220) g,60只均購自安徽醫科大學動物實驗中心,動物生產許可證號:SYXK(皖)2023-4571。飼養環境:室溫 (23～25) ℃,相對濕度50%～60%,飼料由安徽醫科大學實驗動物中心提供,動物可自由飲水攝食。本動物實驗均遵循動物實驗倫理要求。

1.1.2實驗試劑 漢黃芩素(貨號:GD-GSJ532-674;純度>98%)購自遜希公司;二甲雙胍購自大連美侖生物科技有限公司規格:0.25 g /片);鏈脲佐菌素購自齊魯制藥有限公司;24 h 尿蛋白量(24 h-Pro)、 尿素氮 ( BUN )、 肌酐 ( SCr )、 Masson 染色試劑盒均購自碧云天生物技術有限公司; BCA蛋白濃度測定試劑盒、DAB化學發光試劑盒購自南京建成生物技術有限公司;TLR4、MAPK、NF-κB、Col-Ⅰ、Col-Ⅲ蛋白抗體均購自美國Sigma公司。高脂高糖飼料配方(蔗糖 20%+豬油 10%+膽固醇 2.5%+常規飼料 67.5%)。

1.1.3實驗儀器 多功能酶標儀(瑞士羅氏公司);凝膠成像系統(上海勤翔科技有限公司);電泳設備(美國Beckma公司);電子分析天平(德國 Leica 公司);Mini ProteanTeraCell 型垂直電泳轉印系統(美國 Bio-Rad 公司);SC-2546 低速離心機(美國Beckma公司);倒置熒光顯微鏡(蔡司);貝克曼庫爾特 AU5800 全自動生化分析儀 (日本奧林巴斯Olympus有限公司生產,型號: TC-XDS-500C)。

1.2 方法

1.2.1構建DN大鼠模型及實驗分組 除對照組外,其余各組大鼠均采用腹腔注射鏈脲佐菌素 65 mg·kg-1聯合高脂高糖喂養12周的方法構建 DN 大鼠模型。 造模完成后,各組分別連續 28 d 灌胃給予相應藥物或生理鹽水,每天1 次,漢黃芩素低劑量組、漢黃芩素中劑量組、漢黃芩素高劑量組的藥物使用劑量分別為50、100、150 mg·kg-1,二甲雙胍組為陽性對照,其藥物使用劑量為500 mg·kg-1。每組10只大鼠。

1.2.2各組大鼠空腹血糖(FBG)含量檢測 于給藥前至給藥后的28 d內每間隔1周,尾靜脈取血,通過血糖儀測定各組大鼠 FBG 含量。

1.2.3各組大鼠體質量、24 h-Pro、BUN、SCr含量檢測 給藥完成后,收集各組大鼠尿液和血液,離心取上清,并按照試劑盒說明書步驟檢測各組大鼠24 h-Pro和BUN、SCr含量。

1.2.4HE染色檢測腎組織病理損傷 組織固定包埋后石蠟切片,將蠟塊固定在切片機上,切片厚度 4 μm,烘干;脫蠟及水化:二甲苯Ⅰ 20 min→ 二甲苯Ⅱ 20 min→無水乙醇Ⅰ 5 min→無水乙醇Ⅱ 5 min→90%乙醇 3 min→80%乙醇 3 min→70%乙醇 3 min→超純水 3 min;HE 染色:切片置于蘇木精染液 10 min,流水沖洗 10 min 至組織藍化,再浸入伊紅染液 30 s,流水沖洗切片 3 min 后于顯微鏡下觀察染色效果。將染色后的切片于無水乙醇Ⅰ、Ⅱ各脫水 10 min,二甲苯Ⅰ、Ⅱ中各透明 10 min;封片:將封片液滴在組織上并蓋上蓋玻片,于 60 ℃烘干;鏡檢拍照:通過玻掃儀采集圖片。

1.2.5Masson染色檢測腎組織纖維化情況 按照上述步驟將各組大鼠腎組織制成切片,并按照Masson染色試劑盒說明書步驟進行染色,染色完成后在顯微鏡下觀察腎纖維化狀況,并以膠原面積(藍色著色)所占面積百分比計為膠原容積分數(CVF)。

1.2.6免疫組化檢測相關蛋白表達 按照上述步驟將各組大鼠腎組織制成切片,經內源性過氧化物酶阻斷劑阻斷、抗原修復、組織封閉后,滴加NLRP3抗體(1 ∶500),孵育過夜,對應二抗孵育2 h,滴加DAB顯色液,于倒置熒光顯微鏡下觀察染色結果。

1.2.7Western blot檢測相關蛋白表達 通過15% SDS-PAGE分離蛋白質,并在200 mA和1 h條件下,將蛋白質轉移至PVDF膜。將膜在含有5%脫脂奶粉的TBST溶液中于室溫封閉1 h左右。將膜與TLR4、MAPK、NF-κB、Col-Ⅰ、Col-Ⅲ抗體在4℃孵育過夜。用TBST緩沖液洗滌PVDF膜3次,每次10 min,在室溫下與山羊抗兔IgG一起孵育1 h。最后,用ChemiQ4600min化學發光成像系統成像,并通過ImageJ測定蛋白條帶的灰度值。

2 結果

2.1 漢黃芩素對DN大鼠FBG的影響與對照組相比,模型組大鼠給藥前和給藥后第 7、14、21、28 d 的 FBG 含量明顯升高 (P<0.01) ;與模型組相比,漢黃芩素各劑量組和二甲雙胍組大鼠給藥后第 7、14、21、28天的 FBG 含量明顯降低 (P<0.01) ,差異均有統計學意義。見Tab 1。

2.2 漢黃芩素對DN大鼠體質量、24 h-Pro、BUN、SCr的影響與對照組相比,模型組大鼠體質量、24 h-Pro、BUN、SCr含量均升高 (P<0.01) ;與模型組相比,漢黃芩素各劑量組和二甲雙胍組大鼠體質量、24 h-Pro、BUN、SCr含量均降低 (P<0.01) ,差異均有統計學意義。見Tab 2。

2.3 HE染色檢測漢黃芩素對DN大鼠腎組織病理損傷的影響與對照組相比,模型組大鼠腎組織出現肌束紊亂、炎性細胞浸潤、彌漫性水腫、腎小球體積增大、系膜增生,腎小管擴張,腎間質大量炎性細胞浸潤等病理學改變;與模型組相比,漢黃芩素各劑量組和二甲雙胍組大鼠腎組織病理損傷明顯得到改善。見Fig 1。

2.4 Masson染色檢測漢黃芩素對DN大鼠腎纖維化的影響與對照組相比,模型組大鼠腎血管壁及腎小球、腎小管間質絲狀膠原沉淀明顯增多;與模型組相比,漢黃芩素各劑量組和二甲雙胍組大鼠腎組織纖維化明顯得到改善。見Fig 2。

2.5 免疫組化檢測各組大鼠腎組織NLRP3表達情況與對照組相比,模型組大鼠腎組織NLRP3表達明顯增加;與模型組相比,漢黃芩素各劑量組和二甲雙胍組大鼠腎組織NLRP3表達明顯減少 (P<0.01) ,差異均有統計學意義。見Fig 3。

Fig 1 Pathological changes of rat kidney tissue in different treatment groups detected by HE staining (×200)

Tab 1 Effect of baicalin on FBG content of DN rats

Tab 2 Effects of baicalin on body mass, 24 h-Pro and serum BUN and SCr in DN rats

Fig 2 Masson staining of renal fibrosis injury in different treatment groups of rats (×200)

2.6 Western blot檢測TLR4、MAPK、NF-κB、Col-Ⅰ、Col-Ⅲ蛋白表達與對照組相比,模型組TLR4、MAPK、NF-κB、Col-Ⅰ、Col-Ⅲ蛋白表達明顯上調 (P<0.01) ;與模型組相比,漢黃芩素各劑量組和二甲雙胍組TLR4、MAPK、NF-κB、Col-Ⅰ、Col-Ⅲ蛋白表達明顯下調 (P<0.01) ,差異均有統計學意義。見Fig 4。

3 討論

近年來,糖尿病的患病率和發病率在世界范圍內持續上升。DN是糖尿病的主要微血管并發癥之一,也是導致終末期腎病(end-stage renal disease, ESRD)的重要原因之一。然而,目前DN的發病機制仍未完全闡明。大量的報道證明,蛋白尿是DN的主要臨床表現,也是糖尿病并發癥如心血管疾病的重要危險因素。臨床研究顯示,只有通過嚴格控制血壓、血糖、血脂水平以及生活方式干預,才能減緩DN的進展,但仍不能阻止其向ESRD進展[9]。因此,迫切需要尋找新的有效藥物來干預DN。DN的主要病理特征是腎小球硬化和腎小管間質纖維化,抑制腎纖維化已成為DN治療的重要措施之一。在本研究中,我們發現不同濃度的漢黃芩素均能逆轉造模后DN大鼠FBG、體質量、24 h-Pro、BUN、SCr的升高,這就表明漢黃芩素可以改善由造模引起的腎功能下降。此外,HE染色和Masson染色結果同樣證明了這一點,結果顯示不同濃度的漢黃芩素均能逆轉造模后DN大鼠腎組織的病理損傷以及腎臟纖維化程度,然而,漢黃芩素改善DN大鼠腎臟功能的機制仍不清楚,這也是我們研究的重要內容。

Fig 3 Immunohistochemical detection of NLRP3 inflammatory vesicles expression in kidney tissue of rats in different

Fig 4 Changes in expression of related proteins in kidney tissue of each group of rats

近年來,臨床和動物實驗研究中越來越多的證據表明,NLRP3炎癥小體激活參與了包括DN在內的多種糖尿病并發癥的病理過程[10]。NLRP3炎性小體是炎性小體家族中的典型成員,在本研究中免疫組化染色結果顯示,與對照組相比,模型組大鼠腎組織中NLRP3表達明顯增加,而漢黃芩素和二甲雙胍給藥后能夠逆轉造模引起的NLRP3表達的增加。這就提示我們漢黃芩素可能通過抑制腎組織中NLRP3的表達來發揮延緩DN進展的作用,同時說明抑制NLRP3炎癥小體的激活可能為早期DN患者的治療提供了非常有意義的參考[11]。然而,目前對高血糖狀態下腎臟NLRP3炎癥小體激活的分子機制和信號通路尚不清楚,同時,漢黃芩素通過何種分子機制調控NLRP3炎癥小體激活也不明確,需要進一步研究。

TLRs作為模式識別受體,可通過多種炎癥因子的釋放觸發信號級聯。一些分子和細胞事件被認為是NLRP3炎性小體激活的觸發因素,包括K+外排、Ca2+信號、ROS、線粒體功能障礙和溶酶體破裂。有研究顯示,可溶性尿酸通過TLR4介導的信號通路增加人原代腎近端小管上皮細胞中NALP3炎癥小體和IL-1β的表達[12]。此外,還有報道高血糖通過上調TLR4/NF-κB信號通路及其下游NLRP3激活誘導心肌細胞炎癥[13]。因此,我們有理由推測漢黃芩素是否通過靶向TLR4/NF-κB信號通路,減弱NLRP3炎性小體激活引起的腎組織炎癥和纖維化損傷。有研究表明在DM患者體內的TLR4和內源性配體以及其下游激活的NF-κB等信號級聯增加[14-15]。此外,TLR4的下調時會降低NF-κB信號通路的活性以及IL-1、IL-6等炎癥因子的表達,同時,NF-κB也會促進NLRP3、IL -1β和其他促炎細胞因子的合成。而在本研究中,實驗結果證實造模后確實會上調TLR4表達,TLR4高表達會誘導NF-κB和絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)信號通路的激活,進而導致下游的NLRP3炎性小體激活引起DN大鼠的腎組織炎癥和纖維化反應,而漢黃芩素和二甲雙胍給藥后可以不同程度地降低TLR4、MAPK、NF-κB以及膠原蛋白的表達。這就提示漢黃芩素可能通過抑制TLR4/MAPK/NF-κB信號通路的激活,進而減輕由體內血液中高血糖引起的腎組織炎癥和腎臟纖維化,最終發揮改善和延緩DN發生發展的進程。

綜上所述,本研究表明漢黃芩素能在一定程度上減輕DN大鼠的腎臟炎癥反應和腎臟纖維化程度,其機制可能與抑制TLR4/MAPK/NF-κB信號通路的激活有關。