腫瘤微環境中周細胞參與腫瘤轉移的研究進展

章 騰,宋夢瑤,錢 程,趙 楊,2,陸 茵,3,4

(南京中醫藥大學1.藥學院,江蘇省中藥藥效與安全性評價重點實驗室,2.醫學院·整合醫學學院 生物化學與分子生物學系,3.江蘇省中醫藥防治腫瘤協同創新中心,4.江蘇省中醫藥與再生醫學研究國際合作聯合實驗室,江蘇 南京 210023)

轉移是癌癥患者死亡的主要原因。繼發性腫瘤轉移和形成受到腫瘤微環境基質成分的極大影響,例如微環境中的周細胞等基質細胞可干擾腫瘤細胞的增殖和遷移行為。腫瘤細胞自身變化是進行遠端轉移的主要原因,但微環境中基質細胞功能的改變也會加強這一進程。

周細胞是一種能夠調節微循環滲透和血流量的細長星狀多功能細胞,在血管系統中存在著獨特的分布區域,在形態和功能上表現出多樣性[1]。作為血管周圍基質細胞,周細胞通過影響血管穩定性為血管結構支持和調節組織生理提供保障。由于自身在血管發展中的重要功能,也常被推測在腫瘤血管生成中發揮著重要作用。此外,周細胞群體在表型、分布、起源、標記表達和功能方面存在異質性,會隨著時間、器官類型以及微環境的改變而變化。

血管生成是從已成熟的毛細血管及毛細血管后靜脈等血管系統中發展,最終形成血管網絡的復雜過程。在外源性血管生長因子的刺激下,周細胞脫落,內皮細胞增殖遷移形成新管腔。在該過程中,內皮尖端細胞延伸出絲狀偽足,內皮柄細胞連接原有血管,血管滲漏出的大量血漿蛋白作為增殖遷移的臨時介質,最終在血小板衍生生長因子B(platelet derived growth factor subunit B,PDGFB)/血小板衍生生長因子受體β(platelet derived growth factor receptor-beta,PDGFRβ)的作用下募集周細胞,穩固新生血管。正常生理情況下,血管生成主要發生在胚胎、出生后的組織生長以及傷口創面愈合或女性月經過程中[2]。而在腫瘤病理條件下,血管生成也能為腫瘤細胞的生長、增殖甚至轉移提供有利條件,因此常被認為是有害影響。

腫瘤微環境是腫瘤細胞通過自分泌和旁分泌方式改變周圍條件產生的。微環境自身組成是異質的,會根據腫瘤的類型而變化。一般地,它由細胞成分和非細胞成分(趨化因子、白細胞介素、生長因子等)構成。細胞成分又主要涵括中性粒細胞、T細胞、B細胞、巨噬細胞、血管內皮細胞以及周細胞等。其中周細胞參與腫瘤血管生成,與腫瘤細胞的轉移密切相關。在腫瘤微環境中,周細胞的異質性也體現的更為明顯。細胞自身形態或內部分子的改變會引起腫瘤血管的異常滲漏和曲折,甚至為腫瘤細胞的遠端轉移提供有利條件。因此,本文將針對周細胞與血管生成、周細胞的異質性、周細胞與腫瘤轉移以及靶向周細胞治療腫瘤的方案進行綜述。

1 腫瘤微環境中的周細胞與血管生成

腫瘤微環境中,內皮細胞與周細胞之間作用是相互的。周細胞作為包裹和穩定毛細血管的間充質細胞嵌入小血管的基底膜中,通過分泌多種因子促進內皮細胞存活。內皮細胞也能夠通過直接接觸作用影響周細胞形態和胞內基因水平變化。RNA測序結果表明,相比于體外單獨培養,與內皮細胞共培養的周細胞中6 704個基因存在表達差異[3]。除此之外,周細胞也會沉積纖維連接蛋白、層粘連蛋白和串珠素等成分,分泌基質降解酶促進血管基底膜的短暫降解,使內皮細胞從已存在血管向外遷移。

周細胞對于腫瘤血管網絡的發育尤為重要,其覆蓋率的高低已成為衡量腫瘤血管是否完整的重要指標[4]。在腫瘤微環境中,周細胞的減少或缺失可能是腫瘤血管功能喪失、腫瘤細胞轉移的主要因素。因此,周細胞是腫瘤血管調節和腫瘤轉移中的關鍵因素。

1.1 Ang/Tie2周細胞和內皮細胞Tie2作為血管生成素的重要受體,是抗血管生成的重要靶標。當Ang1以自分泌或旁分泌的形式激活周細胞Tie2后,激活胞內Tie2下游蛋白激酶B(protein kinase B,PKB)和轉錄因子叉頭盒蛋白O3(forkhead box O3,FOXO3A)信號傳導從而促進血管成熟。此外,當內皮細胞上的Tie2與周細胞分泌的血管生成素1(angiopoietin1,Ang1)結合后,血管內皮細胞增殖也會受到抑制,內皮細胞連接處收緊以促進新生血管的穩定[5]。而內皮細胞產生的血管生成素2(angiopoietin2,Ang2)作為拮抗劑,與Ang1競爭性結合Tie2破壞周細胞-內皮細胞緊密連接和血管完整性。Teichert等[6]將正常和敲除Tie2后的周細胞分別與內皮細胞共培養,通過體外球體芽生實驗和體內Matrigel實驗證明表達Tie2的周細胞可顯著抑制內皮細胞出芽。而周細胞中特異性敲除Tie2后增強了腫瘤早期的生長能力,在小鼠黑色素瘤和肺癌腫瘤模型中表現出顯著的促血管生成作用,并且在手術切除原發性腫瘤后對腫瘤細胞的轉移進行跟蹤過程中發現:與野生型小鼠相比,周細胞特異性敲除Tie2的基因編輯小鼠肺部可以檢測到更多的轉移灶[6]。由此可見,周細胞中Tie2的缺失不僅能夠在早期階段通過促血管作用加劇腫瘤的生長,而且還可以在腫瘤發生的晚期階段使內部血管更具滲漏性從而促進腫瘤細胞的轉移以及肺部繼發性腫瘤的形成。除此之外,周細胞Ang/Tie2自分泌也能夠發揮維持血管完整性的關鍵作用。Cossutta等[7]研究發現,內含Ang2的內皮細胞特異性細胞器Weibel-Palade小體可以破壞周細胞中的Ang-1/Tie2自分泌信號傳導,從而限制周細胞的遷移能力并降低腫瘤血管上周細胞覆蓋率,為腫瘤細胞轉移提供潛在可能。因此,在腫瘤早期階段或晚期階段靶向血管周細胞Ang/Tie2信號抑制腫瘤生長或腫瘤轉移都可作為一種潛在的治療手段。

Fig 1 Ang/Tie and PDGFB/PDGFRβ in pericytes during tumor metastasis

1.2 PDGFB/PDGFRβPDGFB/PDGFRβ信號對周細胞形態、密度和招募意義非凡。在新生血管中,PDGFB由血管內皮細胞分泌并且固定在血管系統附近的細胞外基質上,形成血管周圍的PDGFB高濃度區域和梯度濃度區域[8]。當梯度濃度末端的PDGFB與周細胞表面的PDGFRβ結合后,周細胞胞內Ras超家族蛋白的激活,自身增殖和遷移能力得到提升[8]。周細胞受到牽引逐漸遷移至內皮細胞的連接處發揮穩固血管和調節血流的作用。PDGFB主要由內皮細胞和巨噬細胞分泌產生。由于內皮細胞和周細胞緊密連接的空間結構,絕大多數的研究聚焦于內皮細胞。然而,在腫瘤微環境中巨噬細胞產生的PDGFB信號對周細胞和血管生成也有重要的調節作用。M0巨噬細胞在膠質母細胞瘤微環境的影響下,胞內促進M2表型轉化的貓眼綜合征關鍵區域蛋白1(cat syndrome critical region protein 1,CECR1)呈現高表達,以旁分泌的形式促進PDGFB的產生,經過信號傳導影響周細胞遷移、招募[9]。在乳腺癌發生發展過程中,LIM同源框基因(LIM homeobox gene 2,Lhx2)直接或者間接促進腫瘤細胞分泌PDGFB,通過PDGFB/PDGFRβ信號轉導誘導血管成熟、原發性腫瘤的生長和轉移[10]。而當周細胞脫離腫瘤血管進入到腫瘤微環境,經PDGF-BB刺激后細胞自身會趨向分化為基質成纖維細胞并表達成纖維細胞特異性蛋白-1(fibroblast specific protein-1,FSP1)特異性基因,從而介導乳腺癌細胞的轉移[11]。Hosaka等[12]將體外PDGF-BB刺激后的周細胞與侵襲性低的T241(小鼠纖維瘤)細胞共同植入小鼠體內后發現:小鼠血液中循環腫瘤細胞數和腫瘤細胞集落顯著增加。這表明PDGFB刺激后的周細胞能夠通過腫瘤血管生成和血管內滲促進原發性腫瘤的生長和轉移。除此之外,在缺乏Pdgf-b或Pdgfr-β基因的小鼠胚胎中,內皮細胞連接蛋白分布出現異常進而引起血管滲漏增加,致使小鼠圍產期死亡[13]

1.3 PI3K周細胞調節內皮細胞及血管結構的能力與自身成熟程度相關。Figueiredo等[14]發現,在毛細血管發芽區域的未成熟周細胞內存在高磷脂酰肌醇3-激酶(phosphatidylinositol 3-kinase,PI3K)信號。隨著周細胞功能基因水平的上調,胞內PI3K信號逐漸減弱。 將PI3Kβ基因敲除后,周細胞增殖能力受到抑制但其成熟程度卻更加明顯。此外,G蛋白信號調節5(regulator-of-G-protein-signaling-5,RGS5)可以調節PI3K-AKT信號并通過TGFβ-pSamd2軸調節干預腫瘤周細胞存活以及腫瘤細胞的擴增和轉移[15]。 使用羧基熒光素二醋酸鹽琥珀酰亞胺酯(carboxyfluorescein succinimidyl amino ester,CSFE)染色的黑色素瘤細胞分別與RGS5low和RGS5high的周細胞共培養,并通過體外遷移、侵襲以及小管形成實驗探究不同類型周細胞對腫瘤轉移的影響。結果證明:經過TGFβ刺激后的RGS5high周細胞組中腫瘤細胞的遷移和小管能力增強[15]。由此可見,腫瘤微環境中不同類型的周細胞對腫瘤細胞的遷移能力的影響存在差異。

2 周細胞在腫瘤內的異質性

周細胞群體會隨著時間、器官類型以及腫瘤微環境的改變而變化,在表型、分布、起源、標記表達和功能方面存在異質性。例如小鼠胚胎心臟中周細胞亞群來源于心臟內皮細胞和骨髓細胞。因此,即使在同一器官內,周細胞的發育來源也可能是異質的。在腫瘤微環境中,這種異質性體現的更為明顯。周細胞自身形態和分子改變會引起腫瘤血管的異常滲漏和曲折,甚至為腫瘤細胞的遠端轉移提供有利條件。因此,不同類型的周細胞在腫瘤微環境中也發揮著不同的功能作用。

腫瘤微環境中,周細胞亞群表型的轉換,影響自身的結構穩定以及細胞間作用。例如:胰腺導管腺癌中周細胞呈現出異位平滑肌α-肌動蛋白(smooth muscle alpha-actin,α-SMA)高表達表型[16]。在腫瘤外泌體刺激下周細胞表型由Desminhighα-SMAlow轉變為Desminlowα-SMAhigh,進而破壞血管完整性最終導致腫瘤血管的異常滲漏[16]。而在RIP1-Tag5小鼠模型中大量腫瘤周細胞表達Rgs5基因,該基因特異性缺失后胞內α-SMA和NG2表達顯著增加,同時促進CD4+和CD8+T細胞的瘤內浸潤,周細胞也更加趨于成熟[15]。乳腺癌中的周細胞異質性也更具特色。乳腺癌本質上屬于一種異質性疾病,不僅具有多樣化的腫瘤細胞,還具備高度動態的微環境,因此存在其中的周細胞在標志物表達和功能上也表現出多樣性。乳腺癌中NG2+或PDGFRβ+周細胞耗竭,可通過提升瘤內缺氧水平促進4T1原發性腫瘤的生長,通過增強上皮-間質轉化過程促進腫瘤細胞的轉移[17]。研究表明[18],乳腺癌患者的低生存期與瘤內NG2low/c-Methigh的周細胞數量存在負相關。此外,乳腺癌周細胞中多能性基因Kruppel樣因子4(Kruppel like factor 4,KLF4)表達增加,也會誘導周細胞表型由成熟、靜止轉變為分化程度較低的狀態—增殖和遷移能力增強并促進細胞外基質的產生。Wong等[19]揭示了腫瘤內存在兩種不同的周細胞亞群:表達和不表達β3整合素。與表達β3整合素的周細胞相比,β3整合素缺失的周細胞促進腫瘤細胞的轉移,提高了肺部結節數。

此外,癌癥干細胞可以產生支持腫瘤血管生成的腫瘤內周細胞[20]。在膠質母細胞瘤中,膠質母細胞瘤干細胞衍生的周細胞攜帶癌癥特異性基因,可以與正常組織周細胞區分開來[20]。

越來越多的證據證明,很大比例的周細胞表達多個標記而不是單個標記并且腫瘤中周細胞亞群可以通過改變基因表達進行表型轉換。因此,使用不同標記的組合確定周細胞表型和腫瘤細胞特性之間的聯系,或許有助于產生更高效的抗血管生成的方法,對于腫瘤周細胞靶向治療也更有意義。

3 轉移前生態位中的周細胞

原發性腫瘤將大量細胞因子和外泌體分泌到血流中,在遠處器官中被攝取誘導產生促纖維化、促炎性微環境,這些微環境被稱為轉移前生態位。微環境具有炎癥、免疫抑制、血管生成、血管通透性、淋巴管生成等特點。

腫瘤血管上的周細胞是腫瘤細胞轉移的關鍵負調節因子,但處于小生境影響下的周細胞也會發揮促進腫瘤細胞轉移的作用。Murgai等[21]研究表明,周細胞能夠在肺中形成轉移前生態位。在植入具有轉移能力的原發性腫瘤后,周細胞從肺脈管系統中脫離并遷移,在轉移前的肺實質中擴張,并成為產生基質的細胞。Murgai等使用Cre/loxP技術敲除周細胞中的特定基因研究肺周細胞在轉移前小生境中的作用。實驗表明:腫瘤衍生因子可誘導周細胞中轉錄KLF4的表達并且KLF4的遺傳失活可以減少細胞纖連蛋白形成[21]。特異性敲除周細胞KLF4也抑制了肺中周細胞的擴張,減少了肺部腫瘤細胞的轉移和定植,但卻不影響原發性腫瘤的生長[21]。此外,β1-整合素中和抗體可破壞與纖連蛋白結合的轉移性腫瘤細胞減少肺轉移。

在過去的十年中,各種免疫細胞被確定為轉移前生態位的基本成分,尤其是中性粒細胞、巨噬細胞。微環境中周細胞還可與免疫細胞相互作用并表現出多種免疫特性。例如:周細胞過表達細胞間黏附分子1(inter-cellular adhesion molecule-1,ICAM-1)和血管細胞黏附蛋白1(vascular cell adhesion protein-1,VCAM-1)等黏附分子參與免疫細胞的血管運輸。

4 靶向周細胞治療腫瘤策略

靶向抑制血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)信號通路是經典的抗血管生成療法,這種方法雖然可以破壞腫瘤內部血管,但也存在著顯著的副作用。例如在使用貝伐單抗等多種抗血管生成藥物后,患者出現高血壓、腎功能障礙、動脈血栓以及心臟病等病癥。因此,單一的抗血管生成療法并不能有效地遏制腫瘤的生長,反而會使腫瘤細胞獲得耐藥性。有文獻表明[22],免疫檢查點抑制劑聯合抗血管生成療法不但可以減輕腫瘤治療的耐藥性還可以加強免疫重編程和血管正常化之間的正反饋循環,調節腫瘤微環境。

近年來,血管正常化治療腫瘤的策略不斷被提及,增加藥物血管灌注或輸送以限制腫瘤細胞的侵襲和加強對腫瘤細胞的殺傷。由于周細胞在多種腫瘤血管中發揮的舉足輕重的作用,因而通過誘導未成熟微小血管招募周細胞穩定血管或通過靶向周細胞抑制轉移前生態位的形成被認為是一種極為有效且獨樹一幟的腫瘤間接療法。因此,研究人員也逐漸聚焦于周細胞分子表達、信號通路并針對其在腫瘤微環境中的功能作用進行研究和探討。成纖維細胞活化蛋白(fibroblast activation protein,FAP)在多種兒童腦腫瘤血管的周細胞中呈現高表達,可將周細胞中FAP作為潛在靶抗原開發藥物或進行治療設計。而在膠質母細胞瘤中,周細胞主要來源于膠質瘤干細胞(glioma stem cell,GSC),因此周細胞的富集往往和藥物治療的預后不良緊密相關。在其微環境中,周細胞控制血管周圍生態位并通過CCL5-CCR5途徑促進膠質瘤細胞DNA修復,提高腫瘤細胞對替莫唑胺耐藥性[23]。利用胸腺嘧啶核苷激酶靶向系統、伊布替尼或更昔洛韋減少甚至消除血管上膠質瘤干細胞來源的周細胞,會致使腫瘤血管破壞、滲漏增加,提高化療藥物治療效益,抑制腫瘤生長[23]。此外,在周細胞覆蓋率高的腫瘤中,使用血管破壞劑的治療效果總是微乎其微,眾多學者猜測周細胞可能作為“屏障”阻斷藥物進入腫瘤組織發揮療效。因此,針對腫瘤血管上周細胞內FAPα酶呈現出特異性高表達這一特點,暨南大學葉文才教授基于酶激活前藥技術,以長春新堿衍生物DAVLBH為母核,設計出提高母體藥物在酶表達細胞靶向性的Z-GP-DAVLBH[24]。該化合物靶向FAPα高表達的周細胞,損壞其骨架結構,進而破壞腫瘤外部或邊緣處的血管,以此減少腫瘤組織的活力[24]。

在患有結直腸癌的病人或小鼠中,PDGFRβ+周細胞出現富集。人工融合人腫瘤壞死因子相關凋亡誘導配體(human tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand,hTRAIL)的ZPDGFRβ親和體可與腫瘤相關周細胞上PDGFRβ高度結合。結合后的hTRAIL被激發可直接殺死腫瘤細胞,也可從周細胞擴散到腫瘤組織中發揮細胞毒性[25]。最近研究表明周細胞具干細胞特性,被認為是高可塑性細胞。Murgai等[21]提出以周細胞多能性KLF4基因作為靶點來預防腫瘤轉移。雖然在部分情況下KLF4是促腫瘤的,但它在特定情況下也可能起到抑制腫瘤生長的作用。

盡管原發性腫瘤的治療取得了重大進展,但腫瘤的轉移仍然是無法避免,這也是癌癥患者死亡的主要原因。腫瘤細胞遠端轉移后可能獲得耐藥性,難以檢測,并且可能會休眠多年,從而給有效治療帶來巨大挑戰。因此,針對轉移性定植的預防性干預可能會極大地改善患者的預后和生活質量。

5 總結與展望

除了公認的參與維持血管完整性之外,周細胞正在成為癌癥進展的調節劑。盡管已經揭示周細胞部分作用,如腫瘤血管生成和轉移前微環境的形成,但對不同器官腫瘤微環境中周細胞功能理解仍然有限。最近有學者稱,腫瘤浸潤性周細胞是異質的,并且周細胞亞群會釋放影響腫瘤內其他成分的重要分子。未來的主要挑戰將是詳細揭示腫瘤浸潤周細胞的重要分子相互作用,并確定其在人類腫瘤微環境中的確切作用。