基于UPLC 指紋圖譜和含量測定的積雪草標準湯劑質量評價研究

呂渭升，楊潔，侯栩軒，梁月儀，李振雨，孫冬梅，陳向東，賈小舟，2

（1.廣東一方制藥有限公司/廣東省中藥配方顆粒企業重點實驗室，廣東 佛山 528244；2.廣州中醫藥大學附屬第一醫院，廣東 廣州 510400）

積雪草為傘形科植物積雪草Centella asiatica（L.）Urb.的干燥全草，夏、秋二季采收，除去泥沙，曬干[1]。積雪草廣泛生長于我國的大部分省份，主產于廣西、貴州、云南等地，又名銅錢草、馬蹄草、錢齒草等，最早收載于《神農本草經》：“味苦，寒；主大熱，惡瘡，癰疽，浸淫赤嫖，皮膚赤，身熱”[2]，具有清熱利濕，解毒消腫等功效[3-4]，臨床上主要用于跌打損傷、傳染性肝炎、流行性腦脊髓膜炎等[5-6]。積雪草所含化學成分中主要包括三萜類、黃酮類、酚酸類、多炔烯烴類，以及揮發油類成分[7]。《中國藥典》2020 年版中以積雪草苷和羥基積雪草苷為指標性成分對積雪草的質量進行控制。羥基積雪草苷具有抗炎、鎮靜、促進肌膚再生、改善肌膚紋理的作用[8]，而積雪草苷能改善皮膚水油平衡，有助于膠原蛋白的合成[9-10]。因此，積雪草不僅具有良好的藥用價值，還具有良好的護膚價值。

中藥飲片標準湯劑理論被提出之后，便成為了中藥現代工藝轉化的標尺，標準湯劑連接了傳統中藥飲片和現代中藥制劑，為控制中藥配方顆粒、經典名方和部分使用水作為提取溶劑的中成藥的質量提供了參照和研究基礎。由于不同的化學成分在水中的溶解度不同，其轉移率也會有差異，導致標準湯劑在化學組成上可能與藥材飲片不一致[11]，因此對中藥湯劑成分的研究更具有臨床指導性意義[12-13]。鑒于積雪草水煎劑和其他現代中藥制劑在臨床上的廣泛應用，為保證用藥的有效性和安全性，本研究共收集了19批不同產地來源的積雪草藥材，炮制成飲片后制備標準湯劑凍干粉，用于建立積雪草標準湯劑的超高效液相色譜（UPLC）指紋圖譜，首次同時測定其中的三萜類成分積雪草苷、羥基積雪草苷和黃酮類成分槲皮素-3-O-葡萄糖醛酸苷3 種活性成分的含量，并使用SPSS 軟件和SIMCA-P 軟件對積雪草標準湯劑指紋圖譜進行主成分分析（PCA），對不同產地積雪草制成的標準湯劑質量進行評價，為積雪草標準湯劑質量的整體評價提供思路。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

YRE-501 小型旋轉蒸發儀（上海亞榮生化儀器廠）；全自動煎藥壺（3 L，深圳一枚王有限公司）；JJ600 百分之一天平（常熟市雙杰測試儀器廠）；ME204E萬分之一天平（梅特勒-托利多公司）；XP26百萬分之一天平（梅特勒-托利多公司）；HZ-D（Ш）臺式循環水真空泵（上海力辰儀器科技有限公司）；DLSB-5/20 低溫冷卻液循環泵（鄭州長城科工貿有限公司）；TRL-0.5 真空冷凍干燥機（大連雙瑞科技有限公司）；LC-40Dxs島津超高效液相色譜儀（島津公司）；HWS28電熱數顯恒溫水浴箱（上海一恒科技有限公司）；KQ-500DE 超聲波清洗機（昆山市超聲儀器有限公司）。

1.2 試劑試藥

積雪草苷對照品（批號：110892-201505，質量分數：91.2%，中國食品藥品檢定研究院）；羥基積雪草苷對照品（批號：110893-201804，質量分數：94.5%，中國食品藥品檢定研究院）；積雪草苷B 對照品（批號：ST78590120MG，質量分數：98.0%，上海詩丹德生物技術有限公司）；異綠原酸C 對照品（批號：wkq18050905，質量分數：98.0%，四川省維克奇生物科技有限公司）；槲皮素-3-O-葡萄糖醛酸苷對照品（批號：CFN92172，質量分數：98.0%，Chem Faces）；乙醇、甲醇（西隴科學股份有限公司），倍他環糊精（上海麥克林生化科技有限公司）為分析純；磷酸（天津市科密歐化學試劑有限公司）、乙腈（默克股份有限公司）、甲醇（默克股份有限公司）為HPLC色譜級；水為實驗室自制超純水。

1.3 樣品及制備方法

19批不同產地收集得到的積雪草藥材信息詳見表1，經廣東一方制藥有限公司孫冬梅主任中藥師鑒定為傘形科植物積雪草Centella asiatica（L.）Urb.的干燥全草，積雪草苷和羥基積雪草苷的總量均符合《中國藥典》2020年版“不得少于0.80%”的規定。

表1 19批積雪草藥材信息表Table 1 Source information of 19 batches of Centellae Herbs

《中國藥典》2020年版一部“積雪草”項下規定積雪草飲片的炮制方法為：除去雜質，洗凈，切段，干燥。本研究對積雪草飲片的具體炮制方法為：取積雪草原藥材，揀去雜質、變質品，洗凈（清水噴淋，并不斷翻動藥材），用鍘刀切制成5～15 mm 的段，干燥，用20 目篩除去碎屑物，即得積雪草飲片。根據《中藥配方顆粒質量控制與標準制定技術要求》相關規定，建立積雪草標準湯劑凍干粉的制備方法步驟為：分別取積雪草飲片約100 g，煎煮次數為2 次，第1次煎煮加水量為12倍，飲片浸泡時間為30 min，煎煮時間為30 min，煎煮后用200 目篩網趁熱過濾，濾液迅速用冷水冷卻，備用。第2 次煎煮加水量為10倍，煎煮時間為25 min，煎煮后用200 目篩網趁熱過濾，濾液迅速冷水冷卻，合并兩次濾液，65 ℃減壓濃縮，冷凍干燥，即得。按此法制得19 批積雪草標準湯劑凍干粉。

2 方法與結果

2.1 色譜條件

采用色譜柱Waters CORTECS T3（2.1 mm×150 mm，1.6 μm）；乙腈為流動相A，含0.15%磷酸的2 mmol/L 倍他環糊精溶液為流動相B，進行梯度洗脫（0～5 min，13%～16%A；5～10 min，16%A；10～25 min，16%～19%A；25～30 min，19%～22%A；30～40 min，22%～24%A；40～45 min，24%～36%A）；流速為0.30 mL/min；柱溫為35 ℃；紫外檢測波長為205 nm；進樣量為1 μL。

2.2 參照物溶液的制備

取積雪草苷對照品、羥基積雪草苷對照品、槲皮素-3-O-葡萄糖醛酸苷對照品、異綠原酸C 對照品、積雪草苷B 對照品適量，精密稱定，加甲醇制成5 種成分質量濃度分別為218.454、209.425、20.145、25.574、13.505 μg/mL 的混合對照品溶液，作為對照品參照物溶液。

2.3 供試品溶液的制備

取積雪草標準湯劑凍干粉適量，研細，取約0.2 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入80%甲醇溶液25 mL，稱定質量，超聲處理（功率250 W，頻率40 kHz）30 min，放冷，再稱定質量，用80%甲醇溶液補足減失的質量，搖勻，濾過，取續濾液，即得。

2.4 指紋圖譜的建立

2.4.1 精密度試驗 取積雪草標準湯劑凍干粉（批號：S4）按照“2.3”項下方法制備供試品溶液，按照“2.1”項下色譜條件連續進樣測定6次。以9號羥基積雪草苷色譜峰為參照峰（S），計算得到各共有峰的相對保留時間RSD值在0.06%～0.14%范圍內，相對峰面積RSD 值在0.68%～1.31%范圍內，均小于3%，表明儀器精密度良好。

2.4.2 重復性試驗 取同一批積雪草標準湯劑凍干粉（批號：S4）6 份，按“2.3”項下方法平行制備6份供試品溶液。按照“2.1”項下色譜條件測定，以9 號羥基積雪草苷色譜峰為參照峰（S），計算得到各色譜峰相對保留時間RSD值在0.01%～0.15%范圍內，相對峰面積RSD值在0.30%～2.84%范圍內，均小于3%，說明該方法重復性良好。

2.4.3 穩定性試驗 取積雪草標準湯劑凍干粉（批號：S4）按照“2.3”項下方法制備供試品溶液，按照“2.1”項下色譜條件，分別在制樣后0、5、12、16、20、23 h 進樣測定，以9 號羥基積雪草苷色譜峰為參照峰（S），計算得到23 h 內各色譜峰相對保留時間RSD值在0.08%～0.23%范圍內，相對峰面積RSD值在0.87%～1.37%范圍內，說明該供試品溶液在23 h內穩定性良好。

2.4.4 指紋圖譜的建立及相似度評價 取19批積雪草標準湯劑凍干粉，按照“2.3”項下方法制備供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件進樣測定，篩選共有峰，并進行積分。將指紋圖譜數據導入“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統（2012 版）”，以S1 號樣品色譜圖為參照圖譜，采用平均數法，經過多點校正，生成疊加圖譜和對照圖譜（R），共標定11個共有峰，見圖1。通過與對照品保留時間及紫外全波長3D 掃描曲線圖比較，指認了其中的5 個成分，分別是峰1 槲皮素-3-O-葡萄糖醛酸苷、峰5 異綠原酸C、峰7 積雪草苷B、峰9 羥基積雪草苷、峰11 積雪草苷，見圖2。以9號羥基積雪草苷色譜峰為參照峰（S），計算得到19 批樣品中11 個共有峰的相對保留時間的RSD 范圍為0.07%～0.50%，相對峰面積的RSD 范圍為4.53%～51.89%，說明11 個共有峰峰面積差異較大。相似度評價結果見表2，19 批樣品指紋圖譜與積雪草標準湯劑對照圖譜（R）的相似度均＞0.900，說明19 批積雪草標準湯劑的化學成分種類一致性較好，主要差異表現在各特征峰所代表的化學成分的含量上。

圖1 19批積雪草標準湯劑UPLC疊加圖譜與對照圖譜（R）Figure 1 UPLC superposition fingerprints and control fingerprint（R）for 19 batches of Centellae Herbs standard decoction

圖2 混合對照品、供試品與陰性樣品的色譜圖Figure 2 UPLC chromatograms of mixed reference substances，test sample and negative sample

表2 19批積雪草標準湯劑相似度評價結果Table 2 Similarity results of 19 batches of Centellae Herbs standard decoction

2.4.5 主成分分析 將19批積雪草標準湯劑指紋圖譜中11個共有峰峰面積導入IBM SPSS Statistics 25軟件，以峰面積為變量，特征值大于1.0 為主成分因子的篩選標準進行PCA 分析，計算得到主成分特征值和方差貢獻率，結果見表3。結果顯示，PCA 共提取2 個特征值大于1 的主成分，累積方差貢獻率達80.428%，大于80%表明提取的前2個主成分可以代表積雪草標準湯劑指紋圖譜共有峰中大部分的信息[14-15]。旋轉后的成分載荷矩陣反映了各變量對主成分的貢獻大小，結果見表4。結果顯示，第1 主成分主要反映了峰2、4、5、6、10對其的貢獻；而峰8、11對第2主成分的貢獻率較大。將共有峰峰面積導入SMICA-P 軟件中，進行無監督模式識別PCA，得到主成分散點圖，結果見圖3。從結果可看出，所有樣品均在95%可信區間內，以產地進行分析，同一產地的樣品斑點分布較為分散，差異較大。而不同產地之間的樣品斑點均存在相互重疊的區域，無明顯性差異，這提示了產地可能不是造成積雪草標準湯劑質量差異的主要因素。

圖3 19批積雪草標準湯劑PCA得分圖Figure 3 PCA score chart of 19 batches of Centellae Herbs standard decoction samples

表3 主成分全部方差分析Table 3 Variance analysis of all the main components

表4 積雪草標準湯劑主成分因子載荷矩陣Table 4 Principal component load matrix of Centellae Herbs standard decoction

2.5 含量測定

2.5.1 供試品溶液的制備及色譜條件 分別同“2.3”、“2.1”項下方法。

2.5.2 對照品溶液制備 取積雪草苷、羥基積雪草苷、槲皮素-3-O-葡萄糖醛酸苷對照品適量，精密稱定，加80%甲醇制成每1 mL分別含150、200和20μg的混合對照品溶液，即得。

2.5.3 專屬性試驗 分別精密吸取“2.2”項下的混合對照品溶液、“2.3”項下供試品溶液及陰性樣品（空白溶劑）溶液1 μL，按“2.1”項下色譜條件依法進樣測定，結果見圖2。結果顯示，待測成分積雪草苷、羥基積雪草苷、槲皮素-3-O-葡萄糖醛酸苷與相鄰成分達到基線分離，陰性樣品無干擾。

2.5.4 線性關系考察 精密稱取積雪草苷對照品18.654 mg、羥基積雪草苷對照品27.113 mg、槲皮素-3-O-葡萄糖醛酸苷對照品5.325 mg，置25 mL 量瓶中，加80% 甲醇制成每1 mL 含積雪草苷680.498 μg、羥基積雪草苷1024.871 μg、槲皮素-3-O-葡萄糖醛酸苷208.740 μg的混合對照品儲備液。

精密量取混合對照品儲備液0.5、1、1.5、2、5、10 mL，分別置于25 mL 量瓶中，加80%甲醇至刻度，搖勻，制得不同濃度的混合對照品溶液，分別含積雪草苷13.610、27.220、40.830、54.440、136.100、272.199 μg/mL，羥基積雪草苷20.497、40.995、61.492、81.990、204.974、409.949 μg/mL；槲皮素-3-O-葡萄糖醛酸苷4.175、8.350、12.524、16.699、41.478、83.496 μg/mL 的系列對照品溶液。按照“2.3”項下色譜條件進樣測定，記錄各個濃度的色譜峰面積。以色譜峰峰面積為縱坐標（y），對照品配制濃度為橫坐標（x），繪制標準曲線，結果表明各對照品在進樣量范圍內線性關系良好。結果見表5。

表5 各成分線性關系Table 5 Linear relationships of various constituents

2.5.5 精密度考察 精密吸取積雪草標準湯劑供試品溶液（批號：S4），按照“2.1”項下色譜條件重復進樣6 次，結果顯示積雪草苷峰面積RSD 為0.45%，羥基積雪草苷峰面積RSD 為0.84%，槲皮素-3-O-葡萄糖醛酸苷峰面積RSD 為1.22%，均小于2%，表明儀器精密度良好。

2.5.6 穩定性考察 精密吸取積雪草標準湯劑供試品溶液（批號：S4），按照“2.1”項下色譜條件，分別在制樣后0、5、12、16、20、23 h 進樣測定，結果顯示，積雪草苷峰面積RSD 為0.42%，羥基積雪草苷峰面積RSD 為0.77%，槲皮素-3-O-葡萄糖醛酸苷峰面積RSD 為1.13%，均小于2%，表明積雪草標準湯劑供試品溶液在23 h內穩定性良好。

2.5.7 重復性考察 按照“2.3”項下供試品溶液制備方法，取積雪草標準湯劑凍干粉（批號：S4）制備供試品溶液6 份，按照“2.1”項下色譜條件進樣測定。結果顯示，積雪草苷平均含量為12.127 mg/g，RSD為1.34%；羥基積雪草苷平均含量為20.243 mg/g，RSD 為1.78%，槲皮素-3-O-葡萄糖醛酸苷平均含量為5.334 mg/g，RSD 為1.64%，均小于2%，表明該方法重復性良好。

2.5.8 加樣回收率測定 精密稱取積雪草苷對照品10.624 mg、羥基積雪草苷對照品16.545 mg、槲皮素-3-O-葡萄糖醛酸苷對照品4.265 mg，置200 mL量瓶中，加80% 甲醇制成每1 mL 含積雪草苷48.445 μg、羥基積雪草苷78.175 μg、槲皮素-3-O-葡萄糖醛酸苷20.899 μg的混合對照品溶液，備用。

取積雪草標準湯劑凍干粉（序號：S4）適量，研細，取約0.1 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，平行6份，每份分別精密加入25 mL上述混合對照品溶液，然后按“2.3”項下方法制備6份供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件進樣測定，結果顯示，積雪草苷、羥基積雪草苷和槲皮素-3-O-葡萄糖醛酸苷的平均加樣回收率分別為100.31%、99.65%、98.70%，結果見表6。根據《中國藥典》2020 年版“藥品質量標準分析方法驗證指導原則”規定樣品中待測成分含量在0.1%～1%時回收率限度為90%～108%，含量在1%～10%時回收率限度為92%～105%，所有數據均在此范圍內，回收率良好。

表6 積雪草標準湯劑各成分加樣回收率試驗結果Table 6 Results of recovery tests for various constituents of Centellae Herbs standard decoction(n=6)

2.5.9 樣品含量測定 取19批積雪草標準湯劑凍干粉，分別按“2.3”項下方法制備19 份積雪草標準湯劑供試品溶液，各平行兩份，按照“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積，計算各批次的積雪草苷、羥基積雪草苷和槲皮素-3-O-葡萄糖醛酸苷的含量，結果見表7、圖4。

表7 19批積雪草標準湯劑的含量測定結果Table 7 Results of the determination of 19 batches of Centellae Herbs standard decoction(n=2)w/%

從表7 可見，19 批積雪草標準湯劑中積雪草苷含量范圍為0.39%～2.54%，羥基積雪草苷含量范圍為1.47%～3.72%，槲皮素-3-O-葡萄糖醛酸苷含量范圍為0.12%～0.60%，RSD 值分別為50.73%、31.51%和49.58%，說明各批次積雪草標準湯劑各有效成分含量有所差異。在三萜皂苷類成分積雪草苷和羥基積雪草苷含量方面，廣西產地相對較高，其他產地差異不大；在黃酮苷類成分槲皮素-3-O-葡萄糖醛酸苷含量方面，除來源于貴州的5 個樣品含量較為穩定外，其他各個產地的樣品差異較大，暫無明顯地域性特征。

3 討論

在供試品溶液制備方法的考察中，先后考察了提取溶劑（甲醇、80%甲醇、60%甲醇、40%甲醇、乙醇、80%乙醇、60%乙醇、40%乙醇）、提取方式（超聲處理和加熱回流）、提取時間（15、30、60 min）和溶劑用量（15、25、50 mL）對指紋圖譜各個共有峰的影響，優選最佳提取參數。結果顯示，采用80%甲醇25 mL，超聲處理30 min提取效率最高。

在色譜條件的考察中，對比了乙腈-2 mmol/L倍他環糊精溶液、乙腈-含0.15%磷酸的2 mmol/L倍他環糊精溶液、乙腈-含0.2%磷酸的2 mmol/L 倍他環糊精溶液、乙腈-0.2%磷酸溶液4種流動相的洗脫效果，結果顯示選取2 mmol/L 倍他環糊精溶液作為水相時，色譜峰的分離度較差；乙腈-0.2%磷酸溶液作為水相時積雪草苷B與羥基積雪草苷兩個成分難以分離；選擇另外兩種流動相洗脫時色譜峰較多，分離效果較好，整體響應度適中且無明顯差異，結合方法的耐用性及保護色譜柱的角度考慮，選取含0.15%磷酸的2 mmol/L 倍他環糊精溶液作為水相。之所以在流動相中加入倍他環糊精是因為積雪草苷B與羥基積雪草苷是一對烏蘇烷型和齊墩果烷型結構的同分異構體，采用普通流動相時往往難以分離，而倍他環糊精則可與不同異構體形成不同空間位阻的包含物，致使它們在色譜柱中的保留時間產生差異，從而達到有效分離[16-17]。

積雪草的三萜皂苷類成分具有抗氧化應激作用、促進組織愈合和改善微循環作用、抗炎、抗焦慮等作用[18-19]。此外，槲皮素-3-O-葡萄糖醛酸苷屬于積雪草中的黃酮醇成分，具有抗感染、抗氧化、抗腫瘤、抗動脈粥樣硬化等多種生物活性作用[20-21]。因此，本研究首次建立了UPLC 法同時測定積雪草標準湯劑中積雪草苷、羥基積雪草苷和槲皮素-3-O-葡萄糖醛酸苷含量的方法。結果顯示3種成分均能在標準湯劑中穩定存在，能有效從飲片提取傳遞至標準湯劑之中。同一產地不同批次的樣品有效成分含量存在著不同程度的差異，例如廣西產地的積雪草苷含量為0.82%～2.54%，羥基積雪草苷含量為1.47%～3.72%，槲皮素-3-O-葡萄糖醛酸苷含量為0.12%～0.41%，最大相差約3.5 倍，其他產地也存著同樣的差異，不同產地之間無明顯的地域性差異。

中藥指紋圖譜具有專屬性高、穩定性好、整體性強的特點，能更全面地反映中藥材整體的化學成分信息。因此，本研究建立積雪草標準湯劑指紋圖譜，共確定了11個共有峰，并指認了其中5個成分，對控制積雪草標準湯劑的質量具有指導意義。相似度結果顯示19 批積雪草標準湯劑與對照指紋圖譜的相似度較高，具有較好的一致性。PCA 結果則顯示不同產地及來源的積雪草標準湯劑樣品無明顯地域性差異。積雪草性喜溫暖潮濕，對栽培土要求不嚴，適應性強，繁殖迅速，水陸兩棲皆可，因此能廣泛分布于國內的大部分地區。有文獻研究得出影響積雪草質量的因素除了產地土壤外，還可能與光照條件、種植密度、肥料等有關[22-23]。另外，藥材的采收季節、產地加工方式、儲存環境等因素也會對積雪草的質量產生一定的影響，下一步可對其他的影響因素進行研究，為積雪草質量標準研究提供參考。