基于頂空-氣相色譜-離子遷移譜結合化學計量學快速鑒別道地陽春砂

李蘇亞，劉亞雄，羅卓雅，

（1.廣州中醫(yī)藥大學中藥學院，廣東 廣州 510006；2.廣東省藥品檢驗所/國家藥品監(jiān)督管理局藥品快速檢驗技術重點實驗室，廣東 廣州 510663）

砂仁是姜科豆蔻屬陽春砂（Amomum villosumLour.）、綠殼砂（Amomum villosumLour.var.xanthioidesT.L.WuetSenjen）或海南砂（Amomum longiligulareT.L.Wu）的干燥成熟果實，是我國著名的“四大南藥”之一[1]。陽春砂主產于廣東，以廣東陽春為道地產區(qū)，目前市場上存在以次充好、以假亂真的現(xiàn)象，使用非道地陽春砂替代道地陽春砂，擾亂市場秩序[2-3]。因此，準確、快速地鑒別道地與非道地陽春砂尤為重要。

目前，文獻報道的鑒別砂仁品種的方法有性狀鑒別法[2]、高效薄層色譜法（HPTLC）[4]、GC-MS法[5-6]、HPLC 法[7]、DNA 條形碼[8]、電子鼻技術[9]等。性狀鑒別法需要經驗輔助，易受主觀因素影響；HPTLC 和HPLC 法樣品前處理復雜，且分析周期較長；GC-MS 可以建立特征性指紋圖譜，靈敏度高且定性能力強，但儀器設備昂貴，檢測成本高；DNA條形碼技術具有高效、精確、易操作的優(yōu)點，但需要建立DNA 條形碼數(shù)據(jù)庫，成本過高；電子鼻技術具有快速便捷的優(yōu)點，但易受環(huán)境因素干擾，分辨率低。

氣相色譜-離子遷移譜（gas chromatography-ion mobility spectrometry,GC-IMS）是氣相色譜（GC）與離子遷移譜（IMS）的結合，主要用于揮發(fā)性和半揮發(fā)性有機化合物的痕量檢測。GC-IMS 主要由毛細管柱、電離源、遷移管、法拉第盤組成。復雜的化合物首先在氣相色譜的毛細管柱中得到分離，再以單個化合物進入遷移管，最后化合物按照遷移速率由快到慢、通過漂移管所需時間由短到長的順序到達法拉第盤被接收，依次出峰，獲得具有保留時間、遷移時間和信號強度的三維譜圖（圖1）[10]。GC-IMS不需要真空泵，具有儀器使用成本低、便攜的優(yōu)點[11-12]，已經廣泛應用于中藥鑒別領域[13-17]，包括中藥道地藥材的鑒定[15]、區(qū)分收獲期和貯藏時間[16-17]和中藥炮制方法[18]等研究。

圖1 GC-IMS的原理圖Figure 1 Schematic diagram of GC-IMS

主成分分析（principal component analysis,PCA）作為一種探索性的方法，從數(shù)據(jù)矩陣中提取的信息由相互正交的主成分（PCs）來解釋，多用于研究數(shù)據(jù)結構和搜索樣本的聚類，常與其他監(jiān)督方法結合使用，如線性辨別分析、K 鄰近算法（k-nearest neighbors algorithm,KNN）等[19]。

本文擬采用頂空-氣相色譜-離子遷移譜（headspacegas chromatography-ion mobility spectrometry,HS-GC-IMS）結合PCA 和KNN 法對道地與非道地陽春砂進行檢測分析，以實現(xiàn)陽春砂的道地性鑒別。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

HS-GC-IMS 儀（德國G.A.S.公司）；MS204S 萬分之一電子天平（瑞士梅特勒-托利多公司）。

1.2 樣品

50 批陽春砂來自廣東陽春、廣西平樂縣和云南保山，經廣東省藥品檢驗所中藥室李華主任藥師鑒定為姜科豆蔻屬陽春砂（Amomum villosumLour.）的干燥成熟果實，樣品信息詳見表1。

表1 樣品信息Table 1 Sample information

2 方法

2.1 樣品前處理

精密稱取陽春砂藥材1.0 g 于20 mL 頂空進樣瓶中，每個樣品平行測定2次。

2.2 分析條件

色譜柱：MXT-5弱極性色譜柱（15 m×0.53 mm，1.0 μm，美國Restek 公司）和MXT-WAX 強極性色譜柱（15 m×0.53 mm，1.0 μm，美國Restek 公司）；柱溫：80 ℃；載氣/漂移氣：氮氣；載氣流量：0～5 min，5～15 mL/min；5～10 min，15～45 mL/min；10～12 min，45～125 mL/min；12～20 min，125 mL/min；進樣針溫度：85 ℃；進樣體積：0.1 mL；頂空溫度：60 ℃；頂空孵育時間：10 min；遷移管長度98 mm；遷移管溫度：80 ℃；遷移氣體流量：150 mL/min；電離源：氚放射性電離源，平均輻射能量5.68 keV；采集方式：正離子模式。

2.3 數(shù)據(jù)處理

采用儀器配套的分析軟件LAV（laboratory analytical viewer）對陽春砂的揮發(fā)性物質進行分析；采用LAV 中的Reporter 插件對比樣品間的圖譜差異，并采用Gallery Plot 插件進行陽春砂特征峰的指紋圖譜對比，對比樣品間的揮發(fā)性物質的差異；運用Int Dynamic Principal Components Analysis（Int Dynamic PCA）插件對陽春砂進行主成分分析；采用Matlab R2022b 軟件對處理后的CSV 數(shù)據(jù)進行PCA 降維，建立KNN 分類模型，分別選擇40批道地陽春砂和10 批非道地陽春砂中75%的樣品作為訓練集，25%的樣品作為預測集，最近鄰居數(shù)量為3，計算識別準確率。

3 結果與分析

3.1 色譜柱的選擇

分別考察MXT-5 弱極性色譜柱和MXT-WAX強極性色譜柱，2種色譜柱的典型圖譜分別見圖2和圖3。可見，2 種色譜柱均能檢測出陽春砂揮發(fā)性成分。

圖3 MXT-WAX色譜柱鑒別陽春砂的代表圖譜Figure 3 Representative graphs of identification of Amomum villosum using MXT-WAX column

采用MXT-5 弱極性色譜柱檢測獲得9 個陽春砂揮發(fā)性特征峰，其中道地陽春砂揮發(fā)性特征峰4個，非道地陽春砂揮發(fā)性特征峰5個，其PCA圖如圖4A，PC-1與PC-2累計貢獻率為84%。

圖4 MXT-5色譜柱（A）和MXT-WAX色譜柱（B）分別鑒別50批陽春砂的主成分分析Figure 4 Identification of principal component analysis of 50 batches of Amomum villosum using MXT-5 column（A）and MXTWAX column（B）

采用MXT-WAX 強極性色譜柱檢測獲得13 個陽春砂揮發(fā)性特征峰，其中包括道地陽春砂揮發(fā)性特征峰3 個，非道地陽春砂揮發(fā)性特征峰10 個，其PCA 圖如圖4B 所示，PC-1 與PC-2 累計貢獻率為88%。因此，采用MXT-WAX 強極性色譜柱能更好地區(qū)分道地與非道地陽春砂。

3.2 取樣量的優(yōu)化

分別稱取陽春砂1-1 和9-1 樣品各0.5、1.0、1.5 g，進樣體積0.1 mL，于60 ℃孵育10 min，考察取樣量對揮發(fā)性特征峰的影響，結果見圖5。可見，道地和非道地陽春砂揮發(fā)性特征峰的總響應強度隨著取樣量的增加而增強，但強度過高時某些峰分離度減少，不利于特征峰建立，同時容易導致儀器污染。因此，選擇取樣量為1.0 g。

3.3 頂空溫度的優(yōu)化

分別稱取陽春砂1-1和9-1樣品各1.0 g，固定進樣體積0.1 mL，分別于40、50、60、70、80 ℃孵育10 min，考察頂空溫度對揮發(fā)性特征峰的影響，結果見圖6。可見，頂空溫度在40～60 ℃范圍內，道地和非道地陽春砂揮發(fā)性特征峰的總響應強度隨著溫度的升高而增強，然而隨著溫度的進一步增加，其總響應強度整體呈下降趨勢。因此，選擇頂空溫度為60 ℃。

圖6 頂空溫度的優(yōu)化Figure 6 Optimization of headspace temperature

3.4 進樣體積的優(yōu)化

分別稱取陽春砂1-1 和9-1 樣品各1.0 g，于60 ℃孵育10 min，分別頂空進樣0.1、0.2、0.5 mL，考察頂空進樣體積對揮發(fā)性特征峰的影響，結果見圖7。可見，道地和非道地陽春砂特征峰的總響應強度隨著進樣體積的增加而降低；非道地陽春砂揮發(fā)性特征峰5、6、7 和道地陽春砂揮發(fā)性特征峰3 的峰強度隨著頂空進樣體積的增加而增強，而非道地陽春砂揮發(fā)性特征峰2、4、8、9、10 與道地陽春砂揮發(fā)性特征峰1、2 的峰強度隨著頂空進樣體積的增加而降低，這可能與共流出物與目標物競爭反應物離子中的質子有關[20]。因此，選擇頂空進樣體積為0.1 mL。

圖7 進樣體積的優(yōu)化Figure 7 Optimization of injection volume

3.5 HS-GC-IMS結合化學計量學對陽春砂的鑒別

采用MXT-WAX 強極性色譜柱檢測50 批陽春砂，使用GalleryPlot 插件生成陽春砂的揮發(fā)性特征峰指紋圖譜見圖8。通過揮發(fā)性特征峰可以大致辨別陽春砂的道地性，但仍具有一定的主觀性。因此，需要結合化學計量學進一步分析。

以陽春砂特征峰對應的峰強度為特征參數(shù)變量，使用主成分分析得到的第一、二主成分圖如圖4B 所示。由圖4B 可知，不同產地的陽春砂的GC-IMS 圖譜經PCA 處理后，可以較好地區(qū)分道地陽春砂和非道地陽春砂；道地與非道地陽春砂樣品之間距離較遠，PC-1與PC-2累計貢獻率88%，表明兩組陽春砂樣品之間差異較大，間接表明HS-GC-IMS對陽春砂道地性鑒別的可能性。

采用KNN 分類算法對經PCA 降維后的數(shù)據(jù)進行分類鑒別，分別選擇不同種類的陽春砂中75%的數(shù)據(jù)作為訓練集，25%的數(shù)據(jù)作為預測集，建立分類模型。結果表明，訓練集和預測集的識別準確率為100%，表明道地陽春砂和非道地陽春砂之間存在明顯的差異性，KNN模型穩(wěn)健、可靠。

4 討論

氣味是中藥重要的性狀鑒別特征，能直接反映藥物整體內在本質，如何運用現(xiàn)代化分析技術實現(xiàn)中藥氣味特征的客觀評價和數(shù)字化分析尤為重要[21]。HS-GC-IMS 直接頂空進樣，保持陽春砂藥材的原有氣味，可快速檢測道地陽春砂和非道地陽春砂的揮發(fā)性物質。根據(jù)揮發(fā)性特征峰的含量差異，通過PCA 可實現(xiàn)陽春砂的快速鑒別。經PCA 降維處理后，建立的KNN 辨別模型，可以更有效地提高數(shù)據(jù)處理效率。

本研究建立了一種HS-GC-IMS 結合化學計量學的方法，用于區(qū)分道地與非道地陽春砂，該方法處理簡單、靈敏度高、結果準確。采用MXT-WAX色譜柱對陽春砂的揮發(fā)性物質進行檢測，以它們的揮發(fā)性特征峰作為陽春砂道地性鑒別的特征參數(shù)，并使用化學計量學方法進行分類鑒別，結果表明主成分分析PC-1 和PC-2 的累計貢獻率為88%，KNN 訓練集和預測集的識別準確率均為100%。本研究可為下一步陽春砂的道地性研究和質量評價提供數(shù)據(jù)支撐，為中藥近源品種的鑒別提供參考方法。