基于TGF-β1/FOXP3/RORγt信號通路探討蘆薈多糖對小鼠自身免疫性甲狀腺炎的保護作用

吳朝文，謝小紅，黎清現，魏洪發，劉嬌

（深圳市龍華區中心醫院內分泌科，廣東 深圳 518110）

自身免疫性甲狀腺炎（autoimmune thyroiditis,AIT）是一種典型的器官特異性自身免疫性疾病，主要以血清甲狀腺自身抗體水平升高和甲狀腺組織損傷為主要特點，甲狀腺組織存在不同程度的淋巴細胞和單核細胞浸潤并伴有甲狀腺細胞凋亡和濾泡結構破壞，最終導致甲狀腺功能減退、臨床甲狀腺腫或甲狀腺組織纖維化[1]。據國外流行病學顯示，AIT 患病率占總人群的1%～2%，可發生在任何年齡段，女性發病約為男性的10 倍[2]。近年來研究表明AIT 的發病與遺傳因素、環境因素、自身免疫、炎癥、氧化損傷、凋亡等因素密切相關[3]。在AIT 早期，目前缺乏有效的治療方法和藥物來阻止疾病的進程，當患者出現甲狀腺功能減退時，只能使用左旋甲狀腺素替代治療，存在停藥后易復發和對甲狀腺自身抗體水平改善作用較小等弊端[4]，因此尋找高效低毒的抗AIT新藥仍是目前研究的重點。

蘆薈為百合科植物庫拉素蘆薈Aloe barbadmsis Miller、好望角蘆薈Aloe ferox Miller或其他同屬近緣植物葉的汁液濃縮干燥物。作為一種常用傳統中藥，其藥用價值很高，最早被1963年版《中華人民共和國藥典》（第一部）收為藥用，并一直錄用至今。蘆薈具有瀉下通便、清肝瀉火、殺蟲療疳的功效[5]。近年來研究發現其主要有效成分-蘆薈多糖具有免疫調節、抗氧化、抗炎、抗凋亡、抗輻射、抗病毒、抗腫瘤等藥理作用[6]。蘆薈多糖可能通過免疫和炎癥調節功能改善AIT，這也是本研究需要驗證的科學問題。

1 材料與方法

1.1 藥物與試劑

蘆薈多糖（成都超九八生物科技有限公司，批號：20220311）；完全弗氏佐劑、不完全弗氏佐劑、碘化鈉和PTg（Sigma 公司）；小鼠TPOAb 化學發光試劑盒和小鼠TGAb 化學發光試劑盒（上海撫生實業有限公司）；小鼠TNF-α、IL-1β、IL-10、IL-17 ELISA檢測試劑盒（上海江萊生物科技有限公司）；小鼠FOXP3、IL-17A、TGF-β1、FOXP3 和RORγt 單抗（中杉金橋公司）；小鼠FT3、FT4和TSH ELISA 檢測試劑盒（武漢華美生物工程有限公司）。

1.2 主要儀器

JY-ZY5 型WB 轉膜電泳儀（北京君意華鑫科技有限公司）；DGG-9070B電熱鼓風干燥箱（上海森信實驗儀器有限公司）；LG10-2.4A 型超速離心機（北京醫用離心機廠）；550 酶標測定儀（日本Bio-red 公司）；FA1004型電子天平（上海天平儀器廠）。

1.3 實驗動物

SPF 級2 月齡雌性C57BL/6J 小鼠30 只，購于遼寧長生生物技術股份有限公司，生產許可證號：SCXK（遼）2020-0001，實驗經廣東醫科大學動物實驗倫理委員會批準，批準號：GDMU-2022-000538。

1.4 方法

1.4.1 分組與給藥 小鼠于SPF 級環境適應性喂養1 周后開展實驗，并隨機分為正常組、模型組和蘆薈多糖組（LHDT），每組10 只。其中蘆薈多糖組灌胃給藥300 mg/（kg·d），其余兩組灌胃給予等量生理鹽水。藥物干預4 周取材。模型組以及LHDT 組通過皮下多點注射PTg+高碘水法建立小鼠AIT模型，模型的建立參照文獻[7]。

1.4.2 指標檢測 給藥干預4周后，異氟烷麻醉小鼠，摘眼球取血，血液4 ℃靜置2 h。4 ℃下3 500 r/min離心10 min，隨后分離血清，ELISA法分別檢測各組小鼠血清FT3、FT4、TSH、TGAb、TPOAb、TNF-α、IL-1β、IL-10、IL-17 水平。采血結束通過頸椎脫臼處死小鼠，小心分離并獲得甲狀腺，生理鹽水沖洗干凈，濾紙吸干，用10%（φ）中性甲醛溶液固定24 h，常規石蠟包埋切片、HE 染色以及封片，光鏡下觀察甲狀腺的組織病理學變化。用玻璃勻漿器于冰上制備10% 甲狀腺勻漿，4 ℃下3 500 r/min 離心10 min，分離上清，嚴格按照ELISA檢測說明書步驟檢測各組小鼠甲狀腺STAT3、RORγt、FOXP3、TGF-β、IL-10 和IL-17 水平。免疫熒光法檢測FOXP3 和IL-17A 水平：甲狀腺石蠟切片組織分別經二甲苯、梯度乙醇和純化水水化后，0.5%TritonX-100 室溫通透20 min，封閉、孵育一抗FOXP3（1∶2 000）和IL-17A（1∶2 000）、洗片、孵育熒光標記二抗（1∶200）、封片，共聚焦熒光顯微鏡下觀察拍照。Western blot 法檢測甲狀腺TGF-β1、FOXP3 和RORγt 蛋白表達水平：加入適量RIPA 裂解液裂解甲狀腺，4 ℃下10 000 r/min 離心10 min，分離上清，BCA 試劑盒檢測甲狀腺總蛋白濃度，分別進行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳、轉膜、封閉、孵育一抗TGF-β1（1∶2 000）、FOXP3（1∶2 000）和RORγt（1∶2 000）過夜、洗膜、孵育二抗（1∶5 000）、洗膜、顯影，Image J 軟件分析條帶灰度值。

1.5 統計學方法

采用SPSS 22.0 軟件進行統計學分析。實驗數據用表示，多組間比較采用單因素方差分析（one-way ANOVA），P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組小鼠甲狀腺病理形態學變化

正常組小鼠甲狀腺腺泡均勻分布且未見炎癥細胞浸潤。模型組小鼠甲狀腺大部分濾泡上皮變性壞死，見大量淋巴細胞浸潤。與模型組比較，蘆薈多糖組小鼠可明顯改善甲狀腺上述病理學變化。見圖1。

圖1 各組小鼠甲狀腺病理形態學觀察（HE染色，n=10，10×）Figure 1 Histopathological changes in the thyroid gland of mice in each group(HE staining,n=3,10×)

2.2 各組小鼠血清FT3、FT4、TSH、TGAb 和TPOAb水平

與正常組比較，模型組小鼠血清FT3和FT4水平明顯降低，而TSH、TGAb 和TPOAb 水平明顯升高（P＜0.01）。與模型組比較，LHDT 組小鼠血清FT3和FT4水平明顯升高，而TSH、TGAb 和TPOAb 水平明顯降低（P＜0.01）。見表1。

表1 各組小鼠血清FT3、FT4、TSH、TGAb和TPOAb水平Table 1 Serum levels of FT3,FT4,TSH,TGAb and TPOAb in each group of mice(±s,n=10)

表1 各組小鼠血清FT3、FT4、TSH、TGAb和TPOAb水平Table 1 Serum levels of FT3,FT4,TSH,TGAb and TPOAb in each group of mice(±s,n=10)

與正常組比較：**P＜0.01；與模型組比較：##P＜0.01。

組別正常組模型組LHDT組c（FT3）/（pmol·L-1）12.59±0.57 7.68±0.33**9.41±0.28##c（FT4）/（pmol·L-1）28.47±1.14 11.36±0.85**20.19±0.67##ρ（TSH）/（IU·mL-1）8.52±0.21 19.27±0.99**14.34±0.74##ρ（TGAb）/（pg·mL-1）102.27±4.62 856.27±75.46**326.36±59.21##ρ（TPOAb）/（pg·mL-1）80.38±5.47 556.26±72.134**226.54±58.41##

2.3 各組小鼠血清TNF-α、IL-1β、IL-10和IL-17水平

與正常組比較，模型組小鼠血清TNF-α、IL-1β和IL-17 水平明顯升高（P＜0.01）。與模型組比較，LHDT 組小鼠血清TNF-α、IL-1β和IL-17 水平明顯降低（P＜0.01），而IL-10 水平明顯升高（P＜0.01）。見表2。

表2 各組小鼠血清TNF-α、IL-1β、IL-10和IL-17水平Table 2 Serum levels of TNF-α，IL-1β，IL-10 and IL-17 in each group of mice (±s,n=10)ρ/（pg·mL-1）

表2 各組小鼠血清TNF-α、IL-1β、IL-10和IL-17水平Table 2 Serum levels of TNF-α，IL-1β，IL-10 and IL-17 in each group of mice (±s,n=10)ρ/（pg·mL-1）

與正常組比較：**P＜0.01；與模型組比較：##P＜0.01。

組別正常組模型組LHDT組TNF-α 61.28±5.34 358.64±72.55**127.95±39.61##IL-1β 82.74±17.36 457.82±74.69**129.37±37.68##IL-10 89.61±2.38 101.52±9.29 156.48±15.88##IL-17 8.74±1.85 56.43±9.76**26.69±5.72##

2.4 ELISA 法檢測各組小鼠甲狀腺STAT3、RORγt、FOXP3、TGF-β、IL-10和IL-17水平

與正常組比較，模型組小鼠甲狀腺STAT3、RORγt、FOXP3、TGF-β、IL-10和IL-17水平明顯升高（P＜0.05）。與模型組比較，LHDT 組小鼠甲狀腺STAT3、RORγt 和IL-17 水平明顯降低（P＜0.01），而FOXP3、TGF-β和IL-10 水平明顯升高（P＜0.01）。見表3。

表3 各組小鼠甲狀腺STAT3、RORγt、FOXP3、TGF-β、IL-10和IL-17水平Table 3 Levels of STAT3，RORγt，FOXP3，TGF-β，IL-10 and IL-17 in thyroid of mice in each group(±s,n=10)

與正常組比較：*P＜0.05，**P＜0.01；與模型組比較：##P＜0.01。

組別正常組模型組LHDT組STAT3/（pg·g-1）5 012.33±588.94 21 125.54±1 021.75**12 362.68±815.67##RORγt/（ng·g-1）52.64±6.28 326.53±61.89**124.62±39.87##FOXP3/（pg·g-1）3 254.24±125.12 4 325.76±605.35*5 123.52±401.65##TGF-β/（pg·g-1）8 268.39±426.62 11 325.58±804.41**14 123.66±409.65##IL-10/（pg·g-1）4 235.61±429.96 6 363.69±612.67**8 174.78±810.25##IL-17/（pg·g-1）255.48±26.32 729.85±64.74**426.25±62.22##

2.5 免疫熒光法檢測各組小鼠甲狀腺FOXP3 和IL-17A水平

與正常組比較，模型組小鼠甲狀腺IL-17A 水平明顯升高（P＜0.01）（圖2J-O 和T）。與模型組比較，LHDT 組小鼠甲狀腺FOXP3 水平明顯升高（P＜0.01），IL-17A 水平明顯降低（P＜0.01）（圖2D—I、M—R、S、T）。

2.6 Western blot 法檢測各組小鼠甲狀腺TGF-β1、FOXP3和RORγt表達水平

與正常組比較，模型組小鼠甲狀腺TGF-β1、FOXP3 和RORγt 水平明顯升高（P＜0.05）。與模型組比較，LHDT 組小鼠甲狀腺FOXP3 水平明顯升高（P＜0.01），而TGF-β1 和RORγt 水平明顯降低（P＜0.01）。見圖3。

3 討論

基于目前治療AIT尚無特效藥，而中藥具有副作用小以及作用靶點多等優勢，可能是潛在的抗AIT新藥的重要來源。長期以來蘆薈一直被認為是一種高效的免疫增強劑，其免疫調節作用已被廣泛報道，例如可改善淋巴細胞增殖、激活補體和抗炎作用[8-9]。而蘆薈多糖已被證實是蘆薈主要的免疫調節化合物[10]。TGAb和TPOAb水平的上調以及甲狀腺大量的淋巴細胞浸潤是AIT的重要診斷標志物。FT3、FT4和TSH 是臨床上甲狀腺功能檢測的重要指標。研究發現模型組小鼠甲狀腺大部分濾泡上皮變性壞死以及大量淋巴細胞浸潤，血清TSH、TGAb和TPOAb水平顯著升高，而FT3和FT4水平明顯降低，提示AIT小鼠模型建模成功。蘆薈多糖干預后可有效改善甲狀腺上述病理學變化和甲狀腺功能。

免疫因素在AIT 的發生發展中起著重要作用[11]。在AIT期間，甲狀腺被T 細胞浸潤，T 細胞介導的自身免疫性損傷是其關鍵發病機制。在自身抗原的刺激下，Treg 細胞和其他T 細胞亞群在胸腺中發育。CD4+T 淋巴細胞在免疫中起著至關重要的作用。未成熟CD4+T 淋巴細胞被抗原提呈細胞、CD28 等共刺激分子激活，在IL-6 聯合IL-1β、IL-23和TGF-β誘導下分化為Th17 細胞[12-14]。CD4+T 細胞作用于靶細胞，促進促炎細胞因子IL-17A 的分泌。RORγt 被認為是發育的關鍵轉錄因子并誘導IL-17A 的分泌[15-16]。而Th17 細胞參與了AIT的發生發展已被證實[17]。本研究發現，模型組小鼠甲狀腺RORγt、TGF-β和IL-17A水平明顯升高，而蘆薈多糖可顯著降低RORγt、TGF-β和IL-17A水平，從而減輕AIT的炎癥進程。Treg 細胞是CD4+T 細胞的一個亞型，Treg 細胞在維持免疫耐受起著關鍵作用。其免疫耐受功能的維持需要FOXP3 的調節。Treg細胞通過分泌TGF-β和IL-10 抑制機體免疫反應，FOXP3 在TGF-β作用下誘導Treg 細胞的成熟，而RORγT 誘導Th17 細胞的成熟[18]。Treg 細胞和Th17細胞在慢性炎癥和自身免疫性疾病中發揮重要作用[19]。本研究發現模型組小鼠甲狀腺TGF-β1、FOXP3 和RORγt 蛋白表達水平明顯上調。給予蘆薈多糖可明顯上調FOXP3 蛋白表達水平，下調TGF-β1和RORγt水平。提示蘆薈多糖通過TGF-β1/FOXP3/RORγt 信號通路調節機體免疫功能改善AIT。

綜上所述，蘆薈多糖對AIT具有較好的保護作用，其作用機制可能是通過調控TGF-β1/FOXP3/RORγt信號通路進而影響機體免疫功能。