UPLC法測定硫酸羥氯喹原料藥有關物質

伍良涌，趙雪梅，李瑋玲，董順玲

（廣州市藥品檢驗所，廣東 廣州 510160）

硫酸羥氯喹（hydroxychloroquine sulfate）化學名為2-(｛4-[（7-氯喹啉-4-基）氨基]戊基｝-乙胺基)乙醇硫酸鹽，最初用于瘧疾治療，上市后主要用于治療類風濕性關節(jié)炎和紅斑狼瘡[1-4]。目前，已有證據(jù)表明羥氯喹對于多種病毒均有抑制作用[5-6]。硫酸羥氯喹在臨床使用中可能發(fā)生不良反應，主要包括皮膚、消化系統(tǒng)、神經系統(tǒng)、視覺及心血管系統(tǒng)損害等[7]。

硫酸羥氯喹國內質量標準有衛(wèi)生部藥品標準（1992）、國家藥品標準YBH 4 份（1、2、3、4）等，國外藥典中歐洲藥典EP11.0、英國藥典BP2022 和美國藥典USP-NF2021 均有收載[8-10]。其中衛(wèi)生部藥品標準（1992）和國家藥品標準YBH 1 的有關物質檢查方法為薄層色譜（TLC）法，方法復雜、費時且不能對雜質進行定量分析；國家藥品標準YBH 2-4 的有關物質檢查方法均為高效液相色譜（HPLC）法，但方法不一致且控制限度不統(tǒng)一，其中國家藥品標準YBH4 建立了2 個液相系統(tǒng)進行有關物質檢查。歐洲藥典EP11.0、英國藥典BP2022 和美國藥典USPNF2021 收載有關物質檢查項為UPLC 法，其中前兩者方法完全相同，明確了7 個已知雜質分別為雜質A、B、C、D、E、F和G。

國家藥品監(jiān)督管理局網(wǎng)站數(shù)據(jù)顯示，硫酸羥氯喹原料藥國內有6家生產企業(yè)涉及6個批準文號[11]。本次研究收集了3家企業(yè)（1、2、3）的樣品，各個企業(yè)需控制的雜質不盡相同，3 家企業(yè)分別明確并提供了各自需要控制的雜質對照品（企業(yè)工作對照品），全部雜質對照品僅用于色譜峰定位，其中企業(yè)1 提供了歐洲藥典EP 列出的7 個雜質對照品和企業(yè)自命名雜質G′、雜質H、雜質I、雜質J 和雜質K；企業(yè)2提供的資料說明與主峰相對保留時間0.6 的雜質為歐洲藥典EP 的雜質C；企業(yè)3 提供了自命名雜質：雜質1、雜質2、雜質3、雜質4、雜質5、雜質8、雜質9、雜質10和雜質11（未提供雜質6和雜質7，僅提供結構式且說明其工藝不產生）。

目前，硫酸羥氯喹及其制劑檢測多為HPLC法[12-14]。本文按羅馬數(shù)字Ⅰ-Ⅻ對各已知雜質命名（詳見表1），參照歐洲藥典EP的方法測定12個已知雜質，結果不能得到完全分離，經方法優(yōu)化、篩選色譜條件的基礎上建立的UPLC 法，可以一次性有效分離各企業(yè)提供的12 個已知雜質，專屬性強、靈敏度高，統(tǒng)一了現(xiàn)有國內質量標準中有關物質檢查方法，為有效控制硫酸羥氯喹中有關物質提供了參考。

表1 硫酸羥氯喹原料中已知雜質比對Table 1 Comparison of known impurities in hydroxychloroquine sulfate API

1 儀器與試劑

Waters ACQUITY UPLC 超高效液相色譜儀，Mettler Toledo XSE205 DU 電子天平，Mettler Toledo S20K pH計。

庚烷磺酸鈉（CNW，分析純）和KH2PO4（廣州市化學試劑廠，化學純）；甲醇（Merck，色譜純）；超純水（Milli-QReferenceA+）；硫酸羥氯喹對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號100582-201902，質量分數(shù)99.3%），其他雜質對照品均為企業(yè)工作對照品；硫酸羥氯喹樣品：企業(yè)1（批號：HS20171125，HS20171126，HS20171127，HS20181101V，HS2018110 2V，HS20181103V），企業(yè)2（批號：C40-170301，C40-170302，C40-170303），企業(yè)3（批號：SQK180407，SQK180408，SQK180409）。

2 方法與結果

2.1 色譜條件

參考歐洲藥典EP 等國外藥典[8-10]并結合企業(yè)意見，通過調整流動相中庚烷磺酸鈉的濃度、梯度比例和色譜參數(shù)建立：以Waters ACQUITY UPLC?BEH C18（2.1 mm×150 mm，1.7 μm）為色譜柱，以磷酸鹽緩沖液（取庚烷磺酸鈉0.25 g 和KH2PO41.36 g，加水900 mL 溶解，用三乙胺調節(jié)pH值7.0，加水稀釋至1 000 mL，搖勻）-甲醇（體積比90∶10）為流動相A，以磷酸鹽緩沖液-甲醇（體積比15∶85）作為流動相B，梯度洗脫（0～1 min，100%A；1～18 min，100%→20%A；18～20 min，20%A；20～25 min，20%→100%A）；流速為0.25 mL/min；柱溫為45 ℃；檢測波長為254 nm；進樣體積為4 μL。

2.2 溶液的配制

2.2.1 系統(tǒng)適用性溶液 取硫酸羥氯喹、雜質B（雜質Ⅱ）和雜質C（雜質Ⅲ）對照品適量，加溶劑[甲醇-水-10%硫酸溶液（體積比50∶50∶0.4），下同]超聲溶解并稀釋制成每1 mL中約含硫酸羥氯喹0.5 mg、雜質B 10 μg和雜質C 10 μg的混合溶液。

2.2.2 對照品溶液的配制 取硫酸羥氯喹對照品適量，精密稱定，加溶劑溶解并定量稀釋制成每1 mL中約含1 μg的溶液。

2.2.3 雜質對照品溶液 取雜質B、雜質C 對照品適量，分別加溶劑超聲溶解并稀釋制成每1 mL中約含雜質B 10 μg、雜質C 10 μg的雜質對照品儲備溶液；取上述雜質對照品儲備溶液適量，分別加溶劑稀釋制成每1 mL中約含雜質B 1 μg、雜質C 1 μg的溶液。

2.2.4 混合對照品溶液 取硫酸羥氯喹、雜質A（雜質Ⅰ）至雜質11（雜質Ⅻ）共12個企業(yè)工作對照品適量，加溶劑超聲溶解并稀釋制成每1 mL中約含硫酸羥氯喹0.5 mg、雜質A（雜質Ⅰ）至雜質11（雜質Ⅻ）分別10 μg的混合溶液。

2.2.5 供試品溶液的配制 取硫酸羥氯喹樣品適量，精密稱定，加溶劑溶解并稀釋制成每1 mL 中約含0.5 mg的溶液。

2.2.6 靈敏度溶液的配制 精密量取對照品溶液5 mL，置20 mL量瓶中，用溶劑稀釋至刻度，搖勻。

2.3 測定方法

精密量取系統(tǒng)適用性溶液、混合對照品溶液、靈敏度溶液、供試品溶液與對照品溶液，分別注入超高效液相色譜儀，記錄色譜圖。雜質計算方法及限度均參考歐洲藥典EP11.0 和英國藥典BP2022，采用加校正因子的主成分外標法計算。

2.4 方法學考察

2.4.1 系統(tǒng)適用性試驗 系統(tǒng)適用性溶液色譜圖中，硫酸羥氯喹峰的保留時間約為16 min，雜質B與雜質C、雜質C 與硫酸羥氯喹峰之間的分離度均應不小于3.0。靈敏度溶液色譜圖中，硫酸羥氯喹峰的信噪比應大于10。系統(tǒng)適用性試驗色譜圖見圖1。雜質B 與雜質C 色譜峰之間的分離度為3.0，雜質C與硫酸羥氯喹色譜峰之間的分離度為13.2；混合對照品溶液色譜圖見圖2，供試品溶液色譜圖見圖3，各雜質峰相對主峰的保留時間見表2。

圖1 系統(tǒng)適用性試驗色譜圖Figure 1 Chromatogram of system suitability test

圖2 混合對照品溶液色譜圖Figure 2 Chromatogram of mixed reference solution

圖3 有關物質供試品溶液色譜圖Figure 3 Chromatogram of related substances in sample solution

表2 各雜質相對保留時間Table 2 Relative retention time of related substances

2.4.2 專屬性試驗 取硫酸羥氯喹（企業(yè)1，批號HS20181101V）適量，進行酸破壞（2 mol/L HCl 溶液、水浴加熱30 min）、堿破壞（2 mol/L NaOH 溶液、水浴加熱30 min）、氧化破壞（30%的雙氧水、水浴加熱30 min）、熱破壞（水浴加熱30 min）、光照破壞（365 nm 照射60 min），并用溶劑稀釋成一系列硫酸羥氯喹破壞性溶液（質量濃度為0.5 mg/mL）。結果顯示，硫酸羥氯喹在酸性、堿性、氧化、熱及UV 破壞條件下相對比較穩(wěn)定，僅在365 nm 紫外光照破壞下雜質B增加，其余破壞方式產生的未知雜質較少，產生的未知雜質和各已知雜質與主峰分離良好，不干擾測定，詳見圖4。

圖4 有關物質專屬性試驗色譜圖Figure 4 Chromatogram of related substances in specificity test

2.4.3 線性關系考察 配制系列質量濃度為0.05～5.00 μg/mL（n=9）的硫酸羥氯喹對照品溶液，分別精密量取4μL，注入超高效液相色譜儀，記錄色譜圖，測定峰面積。以質量濃度（C）為橫坐標、峰面積（A）為縱坐標繪制標準曲線，得線性方程A=26 191.71C+915.20，r=0.999 9，表明硫酸羥氯喹在0.05～5.00 μg/mL質量濃度范圍內與峰面積線性關系良好。

2.4.4 精密度試驗 取對照品溶液連續(xù)測定7次，測得硫酸羥氯喹峰面積的RSD值為0.4%（n=7）。

2.4.5 檢測限和定量限 取硫酸羥氯喹對照品溶液，逐步稀釋、進樣，按信噪比3∶1計算檢測限、10∶1計算定量限，結果分別為0.18 ng和0.60 ng。

2.4.6 穩(wěn)定性試驗 取供試品溶液（批號：HS2017 1125、C40-170301 和SQK180407）室溫放置，分別于0、9、13、18 h進樣測定。結果顯示，雜質個數(shù)無顯著變化，單個雜質和雜質總量基本穩(wěn)定，其中批號為HS20171125 的供試品溶液中雜質B（Ⅱ）、雜質C（Ⅲ）和雜質總量的峰面積RSD 值分別為0.7%、3.3%、2.4%（n=4），批號為C40-170301 的供試品溶液的分別為“未測出”、4.3%、6.2%（n=4），批號為SQK180407 的供試品溶液的分別為2.1%、7.2%、7.0%（n=4），表明供試品溶液在18 h內基本穩(wěn)定。

2.4.7 重復性試驗 取硫酸羥氯喹樣品（批號：HS20171125、C40-170301 和SQK180407）照“2.2.5”方法制備供試品溶液6 份，按“2.1”項色譜條件進樣測定，結果顯示批號為HS20171125 的供試品溶液中雜質B（Ⅱ）、雜質C（Ⅲ）和雜質總量的含量RSD值分別3.6%、3.8%、3.3%（n=6），批號為C40-170301的供試品溶液的分別為“未測出”、3.7%、5.0%（n=6），批號為SQK180407 的供試品溶液的分別為7.5%、10.2%、10.7%（n=6），表明方法重復性良好。

2.4.8 回收率試驗 取約50 mg硫酸羥氯喹樣品（批號：SQK180407），精密稱定，置100 mL容量中，制備6 份，分別加入“2.2.3”項下質量濃度為10 μg/mL 雜質B和雜質C對照品儲備溶液10 mL，稀釋至刻度。精密量取“2.2.3”項下雜質對照品溶液、上述6份溶液各4 μL，注入超高效液相色譜儀，記錄色譜圖和計算回收率。結果顯示，雜質B 的回收率在100.7%～104.3% 范圍內，平均回收率為102.2%，RSD 為1.6%；雜質C的回收率在100.1%～101.8%范圍內，平均回收率為100.8%，RSD 為0.7%，表明方法準確度良好。

2.4.9 有關物質測定結果 12 批樣品測定結果，見表3。可見，企業(yè)1 提供6 批樣品中前3 批樣品結果與后3 批結果有差別，后3 批樣品結果與企業(yè)2、企業(yè)3提供樣品結果比較相近，后9批樣品中雜質B均＜0.1%，雜質C 均＜0.2%，其他單個雜質均＜0.1%，雜質總量均＜0.25%。

表3 有關物質測定結果Table 3 Results of determination of related substance w/%

2.4.10 擬定雜質的限度 采用企業(yè)提供的雜質對照品定位，計算各已知雜質的相對保留時間（見表2），雜質計算方法及限度均參考歐洲藥典EP11.0 和英國藥典BP2022，采用加校正因子的主成分外標法計算。結果測得，擬定限度為雜質B（乘以校正因子1.6）不得過0.15%，雜質C 不得過0.4%，其他單個雜質不得過0.10%，雜質總量不得過0.6%。小于靈敏度溶液主峰面積的雜質峰忽略不計（0.05%）。

3 討論

3.1 硫酸羥氯喹及主要雜質的結構

雜質B（Ⅱ）、雜質C（Ⅲ）和硫酸羥氯喹的結構（圖5）類似，光譜圖（圖6）也基本相同，故本研究選擇雜質B 與雜質C、雜質C 與羥氯喹峰之間的分離度定為方法系統(tǒng)適用性要求。

圖5 雜質結構式Figure 5 Formula of impurities

圖6 硫酸羥氯喹雜質B和雜質C光譜圖Figure 6 Spectrogram of impurity B and impurity C of hydroxychloroquine sulfate

3.2 檢測波長的選擇

歐洲藥典EP11.0/英國藥典BP2022和YBH 2標準，分別采用波長254 nm 和220 nm 測定本品的有關物質，結果表明采用220 nm 檢測基線漂移較大，空白干擾較大（見表4），最終選擇檢測波長254 nm。

表4 2個波長各雜質結果比對表Table 4 Comparison results of two wavelengths for related substancesw/%

3.3 色譜條件優(yōu)化

在實驗過程中發(fā)現(xiàn)，采用不同品牌的庚烷磺酸鈉對基線有一定的影響，分別比較了庚烷磺酸鈉（2個不同批號）和Fisher Chemical的庚烷磺酸鈉，結果同一品牌不同批號或者不同品牌的庚烷磺酸鈉造成的波動大小不一；色譜柱多次進樣后，在主峰保留時間處會有主成分殘留；色譜柱多次進樣后或者庚烷磺酸鈉質量不佳時，基線噪音增大，出現(xiàn)鬼峰。若出現(xiàn)以上現(xiàn)象，建議可采取用10%甲醇溶液和甲醇交替多次沖洗色譜柱，在液相色譜儀混合器之后進樣器之前安裝鬼峰捕集小柱（Nano ChromGhodt-Remover, 2.1 mm×50 mm）減少或消除波動及噪音的影響，更換色譜柱等方法解決。

4 結語

本文參考歐洲藥典方法，結合征集生產企業(yè)的合成工藝和已知雜質，整理出12個已知雜質并重新排序命名，通過適當調整流動相的比例及修改洗脫梯度建立了UPLC 法，有效分離并準確測定硫酸羥氯喹原料藥的有關物質，為硫酸羥氯喹質量控制及生產企業(yè)改進工藝提供了參考。

本研究采用加校正因子的主成分外標法計算有關物質，對硫酸羥氯喹進行了線性關系、精密度、檢測限和定量限方法學考察。選擇雜質B、雜質C和雜質總量為關鍵評估指標對供試品進行了穩(wěn)定性、重復性和回收率考察，其中供試品的主要雜質和雜質總量因測定結果偏小，故穩(wěn)定性和重復性RSD 偏大，但對比實際測試結果偏差均在可接受范圍內。本研究未能獲取商業(yè)化硫酸羥氯喹雜質對照品，12 個雜質對照品均為企業(yè)自制工作對照品純度不高且獲得量少，有待今后改進。

（利益沖突聲明：本研究未受到企業(yè)、公司資助，不存在利益沖突。）