硫化氫對需氧菌性陰道炎相關病原體介導陰道炎癥反應的作用

王冬納，李六民，徐建邦，張意林，周文良，何淑明

[1.中山市小欖人民醫院（中山市第五人民醫院）婦產科，廣東 中山 528415；2.中山大學生命科學學院，廣東 廣州 510275]

需氧菌性陰道炎（aerobic vaginitis,AV）是生育期婦女常見的生殖道感染性疾病，與流產、胎兒感染和早產密切相關[1]。AV 的治療手段包括雌激素、抗菌藥物、抗炎藥物和益生菌療法等[2]。AV 發生的分子機制尚不清楚，治療方案尚未形成共識，有待進一步研究從而提供更有效的治療新策略。

AV 的突出臨床表現是陰道內出現顯著炎癥反應和陰道上皮損傷。需氧性泌尿生殖道病原體的黏附導致局部免疫調節和炎癥反應失衡；促炎細胞因子如IL-6 和IL-1β等在AV 患者陰道中生成顯著增加[3]，這是不良妊娠事件的重要危險因素[4]。AV患者陰道中最常見的致病菌是大腸桿菌（E. coli，7.5%）和金黃色葡萄球菌（S.aureus，4.5%）[5]。當陰道內菌群紊亂時，這些促炎細胞因子促進大腸埃希菌和金黃色葡萄球菌的生長，抑制乳酸桿菌的生長，加劇陰道炎癥[6]。這些致病菌（如大腸桿菌）被用來制備大鼠AV 模型，研究AV 的發病機制和治療措施[7]。

硫化氫（H2S）是一種氣體，產生于各種器官，如大腦、肝臟和心血管系統[8]。H2S在炎癥中的作用與其濃度密切相關：高濃度（病理濃度）的H2S 具有促炎作用，而低濃度（生理濃度）的H2S 具有抗炎作用[9]。研究表明，H2S 通過增強cAMP/蛋白激酶A（PKA）信號軸而激活囊性纖維化跨膜傳導調節子（cystic fibrosis transmembrane conductance regulator，CFTR），從而調控陰道上皮細胞的Cl-轉運[10-11]。CFTR 表達下調促進人陰道上皮細胞內Cl-聚集，而增強炎癥反應[12]。H2S 在AV 炎癥反應中的作用尚不清楚。NaHS 在水溶液中易水解生成H2S 和氫氧根。本研究用它作為H2S 的供體，探討H2S 對需氧性細菌（大腸埃希菌和金黃色葡萄球菌）引起的陰道炎癥反應的作用及其相關分子機制。

1 材料與方法

1.1 材料

人陰道上皮細胞株（VK2/E6E7）購自美國ATCC 公司。胎牛血清（1027-106）購自美國Gibco公司。青霉素/鏈霉素雙抗（WH0518）購自天津市灝洋生物制品科技有限責任公司。Keratinocyte sFm培養基（17005042）購自美國Thermo Fisher 公司。NaHS（16721-80-5）購自安耐吉化學公司。CCK-8試劑盒（C0039）、RIPA 裂解液（P0013B）、PMSF（ST506）和氯離子探針MQAE（S1082）購自碧云天生物科技有限公司。大腸埃希菌（133264）和金黃色葡萄球菌（186335）購自北納生物公司。RNA 提取試劑盒（RP1201）購自百泰克生物技術有限公司。HiScript II Q RT SuperMix 試劑盒（R223-01）購自諾唯贊公司。BCA 試劑盒（23227）購自美國Pierce 公司。PVDF 膜（IPVH00010）購自美國Millipore 公司。牛血清白蛋白BSA（A600332）購自中國生工生物工程股份有限公司。CFTR 一抗（sc-376683）購自美國Santa Cruz 公司。磷酸化p65 一抗（YP0191）和p65 一抗（YM3111）購自美國Immunoway 公司。β-actin 一抗（20536-1-AP）購自美國Proteintech 公司。HRP 偶聯的抗兔二抗（BA1054）和抗鼠二抗（BA1051）購自武漢博士德生物工程有限公司。β-雌二醇（50-28-2）購自美國Sigma Aldrich公司。4%（φ）多聚甲醛（30525-89-4）購自西亞試劑公司。脫蠟劑（CX-001）購自廣西岑溪松香廠。蘇木精溶液（G1004）和伊紅溶液（G1001）購自武漢賽維爾生物科技有限公司。

1.2 實驗動物

40 只SPF 級雌性SD 大鼠，體質量180～220 g，購自廣東省醫學實驗動物中心，生產許可證號：SCXK（粵）2018-0002。動物實驗操作經中山市小欖人民醫院倫理委員會批準（ZSXL-LL2018-038）

1.3 細胞培養與處理

VK2/E6E7 細胞在含10%（φ）胎牛血清和青霉素/鏈霉素（100 u/mL）的Keratinocyte sFm 培養基中培養。為確定NaHS 的最佳濃度，VK2/E6E7細胞在培養皿或板中過夜生長，然后給予不同濃度（1 ～200 μmol/L）的NaHS 孵育24 h 或48 h；NaHS 母溶液用超純水（ddH2O）配制，然后在培養基中稀釋到相應工作濃度。對照組細胞的培養基加入與處理組等量的ddH2O。

1.4 AV細胞模型的制備與NaHS干預

AV 細胞模型制備：VK2/E6E7 細胞與大腸埃希菌或者金黃色葡萄球菌共同孵育24 h。感染的細胞中加入NaHS（20 μmol/L）孵育24 h，進行ELISA、實時定量PCR（qPCR）、蛋白印跡和流式細胞檢測。

1.5 CCK-8檢測

根據產品說明書進行細胞活性測定。細胞處理完成后，將10 μL 的CCK-8 溶液加入到含有100 μL 培養基的孔中，繼續在培養箱中孵育2 h，然后在多功能微孔分光光度計（Thermo Fisher，Multiskoun，美國）中測量450 nm波長處的吸光度值（A）。實驗重復3次。

1.6 qPCR檢測

根據產品說明書操作，使用RNA 提取試劑盒提取樣品總RNA。采用HiScript II Q RT SuperMix試劑盒進行逆轉錄反應。qPCR 引物在探真生物公司合成。引物序列為：ACTB，正向引物：5′-AAGATCAAGATCATTGCTCCTCCT-3′，反向引物：5′-AGCTCAGTAACAGTCCGCCT-3′；IL-6，正向引物：5′-TGGAAATGAGAAAAGAGTTGTGC-3′，反向引物：5′-CGGAACTCCAGAAGACCAGA-3′；IL-1β，正向引物：5′-CCTATGTCTTGCCCGTGGAG-3′，反向引物：5′-CACACACTAGCAGGTCGTCA-3′。qPCR在20 μL反應體系中進行：1 μL cDNA，1.6 μL引物，10 μL SYBR，和7.4 μL ddH2O。反應條件為94 °C，30 s；60 °C，20 s；72 °C，20 s；40 個循環。實驗重復3次。

1.7 蛋白印跡檢測

細胞在含有PMSF（2 mmol/L）的RIPA 裂解液中裂解，使用BCA試劑盒檢測樣品的蛋白濃度。蛋白樣品（10 μg/條帶）在SDS-PAGE 凝膠中以80～120 V 電壓進行電泳分離1.5 h。以250 mA 電流轉移100 min將凝膠中蛋白轉移到PVDF膜上。PVDF膜在室溫下與TBST（含5% BSA）孵育1.5 h 進行封閉。PVDF 膜在4 °C 與以下一抗抗體孵育過夜：CFTR 一抗（1∶1 000）、磷酸化p65 一抗（1∶1 000）、p65 一抗（1∶1 000）和β-actin 一抗（1∶1 000）。PVDF膜用TBST 洗3 遍后，在室溫下與HRP 偶聯的抗兔/抗鼠二抗（1∶7 500）共同孵育2 h。印跡膜使用TanonTMHigh-sig ECL 底物按照產品說明進行孵育，在Tanon-5200 化學發光成像系統獲取和分析蛋白印跡圖像。實驗重復3次。

1.8 流式細胞檢測

細胞經胰蛋白酶消化獲取細胞懸液，離心去上清。用PBS 洗滌3 次后，將細胞沉淀與含5 mmol/L MQAE 的Krebs-HEPES 溶液混勻，在室溫下避光孵育30 min。用PBS 洗滌細胞3 次后，使用流式細胞儀（Novocyte2040R，ACEA，美國）和NovoExpress軟件進行分析。測量并比較各組的平均熒光強度（MFI）。實驗重復3次。

1.9 AV動物模型與分組給藥

將40 只大鼠隨機分為5 組，每組8 只，分別為：對照組、E. coli感染組（E. coli）、E. coli感染+NaHS處理組（E.coli+NaHS）、S.aureus感染組（S.aureus）和S.aureus感染+NaHS 處理組（S.aureus+NaHS）。AV 大鼠模型制備參照文獻[13]方法進行。給予大鼠每天皮下注射0.5 mgβ-雌二醇，持續2 d 以誘導發情。通過用無菌棉簽摩擦陰道組織50 次造成陰道壁機械性損傷。隨后，將E.coli或S.aureus菌液（0.025 mL/100 g，3×107CFU）灌入陰道，并保持陰道呈朝上以防止溶液流出，連續灌注6 d；對照組陰道灌注等量生理鹽水。NaHS 濃度為400 μmol/L。NaHS 治療（E.coli/S.aureus+NaHS 組）從感染的第6 天開始進行。每只大鼠每天經陰道注射NaHS 溶液100 μL，連續3 d。在完成最后一次治療24 h后，經麻醉后處死大鼠并收集陰道組織進行蘇木精-伊紅（hematoxylin and eosin，HE）染色和qPCR分析。

1.10 HE染色

陰道組織用4%（φ）的多聚甲醛固定，制作蠟塊切片（3 μm）。切片在60°C 下孵育2 h后，使用脫蠟劑脫蠟10 min，用100%、95%和75%酒精對切片進行水合處理。組織切片HE 染色、漂洗、脫水、清理和封片，在顯微鏡下成像。

1.11 統計分析

實驗數據以表示。使用GraphPad Prism 9軟件進行統計分析。兩組和兩組以上的組間差異分別使用Student'st檢驗和單因素方差分析（Bonferroni檢驗）進行比較。P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 NaHS對AV大鼠陰道炎癥反應的作用

陰道組織HE 染色顯示，對照組大鼠的陰道組織呈現有序排列的分層鱗狀上皮和緊密的黏膜層，E.coli和S.aureus感染組大鼠的陰道組織黏膜層增生和上皮下炎癥細胞浸潤（如中性粒細胞和單核細胞）。與感染組相比，NaHS 干預組大鼠的陰道組織黏膜層增生和上皮下炎癥細胞浸潤明顯減少（圖1A）。與對照組相比，E.coli或S.aureus感染組大鼠陰道組織的IL-6（圖1B）和IL-1β（圖1C）mRNA表達顯著增加，差異有統計學意義（P＜0.05）；與感染組相比，NaHS 干預組的IL-6 和IL-1βmRNA 表達顯著降低，差異有統計學意義（P＜0.05）。

圖1 NaHS對E.coli或S.aureus感染大鼠陰道組織形態變化和促炎細胞因子表達的影響Figure 1 Effect of NaHS treatment on morphological changes and proinflammatory cytokine expression in vaginal tissues of rats infected with E.coli or S.aureus(n=3)

2.2 NaHS 對E.coli 或S.aureus 誘導的陰道上皮細胞炎癥反應的影響

CCK-8 結果顯示，NaHS 在濃度范圍1～200 μmol/L 時，與VK2/E6E7 細胞孵育24 h 對細胞活性沒有明顯影響，組間差異無統計學意義（P＞0.05，圖2A）。當孵育時間延長至48 h，細胞活性降低，與對照組相比，差異有統計學意義（P＜0.05，圖2B）。后續實驗選擇24 h作為NaHS處理的時間點。

圖2 NaHS對陰道上皮細胞活性的影響（n=3）Figure 2 Effect of NaHS on vaginal epithelial cell viability(n=3)

ELISA結果顯示，與對照組相比，E.coli或S.aureus感染24 h 顯著增加促炎細胞因子（IL-6 和IL-1β）的表達，差異有統計學意義（P＜0.05，圖3A—D）。與感染組相比，NaHS 干預組呈濃度依賴性地降低E.coli或S.aureus感染細胞中IL-6 和IL-1β的水平，差異有統計學意義（P＜0.05，圖3A-3D）。基于這些結果，本研究選擇20 μmol/L NaHS作為后續實驗的干預條件。

圖3 NaHS對E.coli或S.aureus感染VK2/E6E7細胞中炎癥細胞因子表達的影響Figure 3 Effect of NaHS on proinflammatory cytokine expression in VK2/E6E7 cells stimulated with E.coli or S.aureus(n=3)

與ELISA 結果一致，qPCR 結果顯示，E. coli或S. aureus感染細胞的IL-6 mRNA 表達水平比對照組高，分別約為對照組的1.5 倍和1.6 倍。與感染組相比，NaHS（20 μmol/L）干預組細胞的IL-6（圖3E）和IL-1β（圖3F）mRNA 表達水平顯著下降，差異有統計學意義（P＜0.05）。

2.3 NaHS 對E.coli和S.aureus感染陰道上皮細胞NF-κB 信號通路的影響

如圖4 所示，與對照組相比，E.coli或S.aureus感染組細胞的p-p65蛋白表達和p-p65/p65比值顯著升高，差異有統計學意義（P＜0.05）。與感染組相比，NaHS干預組細胞的p-p65蛋白表達和p-p65/p65比值顯著降低，差異有統計學意義（P＜0.05）。

2.4 NaHS 對E.coli 或S.aureus 感染陰道上皮細胞中的細胞內Cl-的影響

使用MQAE 作為細胞內Cl-的熒光指示劑。流式細胞檢測結果顯示（圖5），與對照組相比，E.coli感染組VK2/E6E7細胞胞內Cl-增加了1.5倍，差異有統計學意義（P＜0.05）。與感染組相比，NaHS干預組細胞內Cl-顯著降低，差異有統計學意義（P＜0.05）。

圖5 NaHS對E.coli或S.aureus感染的VK2/E6E7細胞內Cl-濃度的影響Figure 5 Effect of NaHS on intracellular Cl- concentrations in VK2/E6E7 cells stimulated with E.coli or S.aureus(n=3)

蛋白印跡結果顯示（圖6），對照組、感染組和NaHS 處理組間的CFTR 蛋白表達的差異無統計學意義（P＞0.05）。

圖6 NaHS對E.coli或S.aureus感染的VK2/E6E7細胞CFTR表達的影響Figure 6 Effect of NaHS on CFTR expression in VK2/E6E7 cells stimulated with E.coli or S.aureus(n=3)

3 討論

本研究結果表明NaHS 能抑制需氧菌陰道炎相關病原體E.coli或S.aureus感染引起的陰道炎癥反應，同時發現NaHS 能抑制這些病原菌誘導的NFκB信號通路激活和細胞內Cl-的聚集。

需氧菌性陰道炎的主要特點是炎癥反應明顯增強，促炎細胞因子（如IL-1β和IL-6）水平升高[2]。本研究結果顯示，E. coli和S. aureus感染使VK2/E6E7 細胞釋放的IL-1β和IL-6 顯著增加，而NaHS干預呈濃度依賴性降低這些促炎細胞因子的水平。與ELISA結果一致，NaHS顯著降低E.coli和S.aureus感染VK2/E6E7細胞中IL-6和IL-1β的mRNA表達。NaHS 是一種快速釋放的H2S 供體[14]。本研究結果表明NaHS 抑制E.coli和S.aureus感染引起的陰道上皮細胞炎癥反應。與細胞實驗結果一致，NaHS也顯著抑制E.coli和S.aureus感染引起的AV 大鼠陰道組織中IL-6 和IL-1βmRNA 的過度表達和陰道組織的病理改變。本研究結果與曾佳洪等[15]報道的一致，曾佳洪等的研究顯示在小鼠燒傷模型中，NaHS 通過降低包括IL-6 和IL-10 在內的一系列促炎細胞因子水平，顯著抑制炎癥反應。多項研究表明低濃度H2S（或H2S 供體）具有顯著抗炎效應[9，16]。本研究揭示H2S對需氧菌性陰道炎相關病原菌感染引起的陰道炎癥具有抗炎效應。

研究表明，滴蟲性陰道炎感染通過降低陰道上皮細胞中CFTR 的表達而阻斷細胞內Cl-分泌，進而導致細胞內Cl-聚集[17]。在脾細胞、內皮細胞和膽管上皮細胞中，CFTR 表達減少或者活性降低可導致細胞內Cl-堆積而促進炎癥反應[18-20]。CFTR 功能缺陷的促炎作用與激活NF-κB 信號通路密切相關，而恢復CFTR 的表達則抑制NF-κB 介導的炎癥反應[19，21]。H2S 通過激活CFTR 調節陰道上皮細胞中的Cl-離子轉運[10]。本研究顯示，E. coli和S. aureus感染誘發陰道炎癥反應和激活NF-κB 信號通路，導致陰道上皮細胞內Cl-聚集，這些效應顯著被NaHS抑制。研究結果表明H2S 抑制E.coli和S.aureus感染誘發的陰道炎癥反應和NF-κB 信號通路，活化未通過調控CFTR 表達來實現。H2S 是否通過調節CFTR 通道活性而發揮其抑制需氧性病原菌誘發的陰道炎癥還有待進一步研究。

綜上所述，本研究表明，H2S 可能是通過抑制陰道上皮細胞內Cl-聚集而阻止NF-κB信號通路活化，從而抑制E. coli和S. aureus感染引發的陰道炎癥反應。