元寶楓籽油膳食補充對大鼠腸道菌群和代謝物的影響

張 珂, 常婷婷, 陳顯揚, 紀寶明, 宋王婷

(北京林業大學草業與草學院1,北京 100083) (寶楓生物科技(北京)有限公司2,北京 101300)

元寶楓(AcertruncatumBunge)是我國特有的樹種,具有景觀造林、油品加工及醫學用藥等方面的應用和開發價值[1]。元寶楓籽油富含亞油酸(C18∶2)、油酸(C18∶1)等不飽和脂肪酸,質量分數高達92%,優于其他食用油,如葵花籽油、菜籽油和花生油等[2]。另外,元寶楓籽油中質量分數為3%～7%的是神經酸,一種來源稀少但對人類健康,尤其是在大腦發育和維護方面至關重要的極長鏈脂肪酸[3]。元寶楓籽油于2011年獲我國衛生部批準作為新資源食品,也是可用于量產神經酸的重要木本油料資源之一[4]。

代謝組學是一種涉及對生物系統中完整的內源代謝物進行全面分析的方法[5]。隨著對內源性代謝物的整體及其變化的檢測、量化和分類,探索生物體代謝變化規律或變化過程的本質[6]。脂質在生命活動中扮演十分重要的角色,對生物體的健康及疾病發展具有深刻意義。脂質組學作為代謝組學的一個分支,越來越多應用于生物體疾病的發生與發展等方面的研究。

腸道菌群是人體最大的微生態系統,對人體的物質和能量代謝具有重大影響。腸道菌群的構成受到飲食等各種環境因素的影響[7]。微生物-腸-腦軸是腸道菌群、腸道和大腦之間的雙向通訊網絡,通過炎癥及內分泌系統相互作用調節免疫、胃腸和中樞神經系統功能[8]。膳食脂肪酸攝入對塑造微生物群落組成方面具有重要作用[9]。腸道菌群及其代謝物不僅調節人體健康,而且在連接飲食和宿主方面具有重要意義[10]。大量研究表明宿主先天/適應性免疫系統與腸道菌群之間存在動態相互作用[11, 12]。腸道菌群的失調可能會損害宿主的免疫反應并導致各種炎癥性疾病的發展[10]。在小鼠模型中,元寶楓籽油膳食補充能有效抑制由高脂[13]或脂多糖[14]攝入導致的腸道炎癥反應及代謝紊亂等問題,并促進腸道健康。孫朋浩等[15]通過對小鼠喂食元寶楓籽來探究其腸道菌群的變化,發現元寶楓籽對機會性致病菌具有一定程度的抑制作用。元寶楓籽中的脂肪酸對腸道菌群及代謝物的影響,以及二者之間的相互作用鮮見報道。

實驗室前期工作已證明了元寶楓籽油的膳食補充可促進動物學習和記憶能力顯著提高,并通過對血清和腦組織的脂質組學分析找出了起效的生物標志物和潛在的代謝通路[16]。為進一步了解元寶楓籽油的攝入對腸道菌群及腸-腦軸的潛在影響,采用16 S rDNA測序技術聯合脂質組學的手段,對攝入元寶楓籽油后大鼠的腸道菌群和糞便代謝物進行綜合分析,為元寶楓籽油針對腸-腦軸相關的醫藥開發提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

6～8周齡雄性SD大鼠,體重180～200 g,購于維通利華實驗動物中心(中國北京)。動物均處于室內溫度(22±2)℃、相對濕度45%、12 h晝夜循環采光的適宜環境中,可自由進食、飲水。

乙腈和甲醇均為色譜級。

元寶楓籽油的成分由中國北京PONY譜尼測試集團,以GB 5009.168—2016《食品安全國家標準 食品中脂肪酸的測定》[17]方法測定,結果詳見表1[16]。

表1 元寶楓籽油的脂肪酸構成[16]

1.2 儀器與設備

ACQUITY超高效液相色譜(UPLC),XEVO-G2XS三重四極桿飛行時間(QTOF)質譜,電噴霧離子源(ESI)。

1.3 方法

1.3.1 動物實驗方法及樣品采集

20只大鼠隨機分為兩大組(n=10/組):對照組和處理組。大鼠在正式實驗前適應性飼養1周。元寶楓籽油通過灌胃法進行飼喂。根據衛生部2011年第9號文件的推薦用量,神經酸的每日補充劑量應不高于300 mg,以人體重60 kg,人與大鼠的給藥換算系數6.3,可計算出神經酸的給藥量為30mg/kg。研究中神經酸在元寶楓籽油中質量分數6.8%,計算可得元寶楓籽油的給藥劑量為442 mg/kg。為避免其他油料中含有同類脂肪酸對研究的干擾,給對照組灌胃相同劑量生理鹽水。所有動物連續灌胃7 d,收集第1天、第7天的糞便樣本,于-80 ℃備用。

本實驗單位使用許可證編號為SCXK(京)2016-0006;動物質量合格證編號為No.11001119110-67847。實驗經北京維通利華實驗動物技術有限公司機構實驗動物管理和使用委員會批準,符合實驗動物飼養和使用的相關規定。通過北京維通利華實驗動物技術有限公司機構實驗動物管理和使用委員會的動物倫理審查(No. P2019070)。

1.3.2 腸道菌群16 S rDNA測序

大鼠糞便樣本委托杭州聯川生物技術股份有限公司進行16 S rDNA高通量測序分析。提取樣品總DNA后檢測樣品的純度和濃度。對16 S rDNA基因的V3+V4測序區域用通用引物進行PCR擴增。AxyPrep DNA GelExtraction Kit用于純化擴增子。產物經過定量和均一化后形成測序文庫,隨后進行文庫質檢,合格的產物使用IlluminaMiSeq平臺對其進行測序。

1.3.3 脂質組學樣品制備

稱取0.1 g糞便樣品于1 mL預冷的異丙醇中,渦旋1 min后在室溫靜置10 min,隨后將混合物在-20 ℃儲存過夜。之后將樣品在14 000 r/min下離心20 min,將上清液轉移到新試管中,以V異丙醇∶V乙腈∶V水=2.5∶1∶1,稀釋至110,儲存在-80 ℃備用。

1.3.4 脂質組學測定方法

樣品通過ACQUITY的UPLC和XEVO-G2XS QTOF質譜和ESI進行分析。樣品脂質成分分離在Acquity超高效液相色譜與C18反相色譜柱(2.1×100 mm,1.7 μm,Waters)上進行。流動相為:A相為含有0.1% 甲酸乙腈/水(60∶40)的10 mmol/L甲酸銨溶液;B相為含有質量分數0.1%甲酸異丙醇/乙腈(90∶10)的10 mmol/L甲酸銨。流動相的流速為0.4 mL/min,初始條件為B相40%。按照洗脫條件對樣品進行分離洗脫:0～2 min,B相40%、2～2.1min,B相43%、2.1～12 min,B相50%、12～12.1 min,B相54%、12.1～18 min,B相70%、18～18.1 min,B相99%、18.1～20 min,B相回到40%。

樣品進樣量為1 μL。采用Xevo-G2XS QTOF質譜儀檢測陽性和陰性模式的脂質離子,質譜儀在m/z為50～1200的MSE模式下操作,采集時間為0.2 s。源溫度為120 ℃。脫溶劑溫度為550 ℃,氣體流量為1 000 L/h,流動氣體為氮氣。毛細管電壓為2.0 kV (+)/1.5 kV(-),錐體電壓為20 V。以亮氨酸腦啡肽(200 pg/μL,V乙腈∶V水=1∶1)作為鎖定質量用于精確質量測定,并用0.5 mmol/L甲酸鈉溶液進行校正。

1.4 數據處理分析

1.4.1 微生物多樣性分析

使用Greengenes數據庫(V.13.8)選擇具有100%相似性的操作分類單位(OTU)進行分類鑒定,以分析16 S rDNA測序數據[18]。將OTU的代表性序列與微生物參考數據庫進行比對,得到每個OTU對應的物種分類信息,然后統計每個樣本的組成(門、綱、目、科、屬和種)。在此基礎上,利用QIIME2軟件生成了不同分類級別的物種豐度表。

1.4.2 脂質組數據處理

原始質譜數據集在Waters XEVO-G2XS QTOF儀器上生成,并由Progenesis QI 2.0軟件處理。為了識別和評估兩組間的特征,使用MetaboAnalyst網站進行組學分析,并用R語言中vegan 26包中進行單變量和多變量分析。

2 結果與分析

2.1 腸道菌群變化分析

大腦發育及功能維持與存在于人體腸道中的復雜菌群結構有關[19]。腸-腦軸對維持穩態具有重要意義,而腸道菌群被認為是腸-腦軸調節的關鍵之一[20]。連續補充元寶楓籽油7 d后,采集第1天和第7天2組大鼠的糞便樣本,利用16 S rDNA基因測序對V3和V4區域進行焦磷酸測序,分析腸道菌群的構成變化。如圖1所示,處理組和對照組之間Chao1指數、Simpson指數和Shannon指數沒有顯著,說明元寶楓籽油的補充對大鼠腸道菌群的多樣性和豐富度沒有顯著影響。進一步在門、綱、目、屬水平上分析菌群豐度的結果顯示,元寶楓籽油的補充使得對照組和處理組之間的腸道菌群構成出現了顯著差異(圖2a～圖2e)。

圖1 大鼠腸道菌群alpha多樣性指數

注:*表示與對照相比P<0.1。

門水平上,厚壁菌門(Firmicutes)和擬桿菌門(Bacteroidetes)是優勢菌門。元寶楓籽油處理第7天厚壁菌門豐度顯著下降,而擬桿菌門顯著上升(圖2a)。研究表明,在阿爾茨海默病模型的小鼠和患者中,厚壁菌門和放線菌門的豐度會增加,而擬桿菌的水平會降低[21, 22]。并且隨著疾病的發展,失調的菌群會影響神經炎癥和淀粉樣蛋白變性的發生[21]。

元寶楓籽油的補充對梭菌綱(Clostridia)和梭菌目(Clostridiales)均有顯著的調節作用(圖2b、圖2c)。PAP小鼠是常用于研究阿爾茲海默病的模型動物,研究發現,PAP鼠腸道菌群中梭菌綱和梭菌目的豐度長期低于正常動物水平[23]。而梭菌綱和梭菌目均對于元寶楓籽油的攝入響應較為敏感。

屬水平上,艾克曼菌(Akkermansia)、羅姆布茨菌(Romboutsia)和Paramuribaculum豐度在第1天和第7天均顯著降低,而擬桿菌屬(Bacteroides)顯著增加。在自閉癥鼠模型研究發現,其腸道艾克曼菌水平顯著提高[24],擬桿菌豐度顯著下降[25]。近年來研究人員將基于調整腸道菌群的手段應用于自閉癥和情感障礙患者的治療當中,獲得了有效的改善[26]。此外,乳桿菌屬(Lactobacillus)和瘤胃球菌(Ruminococcaceae)_UCG-013的豐度明顯降低,而瘤胃球菌_UCG-014顯著提高;處理組的瘤胃球菌_UCG-014和毛螺菌(Lachnospiraceae)_NK4A136在第7天顯著下降,而普雷沃氏菌(Prevotellaceae)_UCG-001和普雷沃氏菌_NK3B31顯著增加(圖2e)。擬桿菌與體內的物質和能量代謝有關[27]。普雷沃氏菌參與腸黏膜黏蛋白的合成、發酵可溶性纖維、產生具有營養神經細胞和抗炎作用的短鏈脂肪酸[28]。阿爾茲海默病的發展過程中,瘤胃球菌_UCG-014和毛螺菌與促炎性外周免疫T細胞(Th1)和神經炎性小膠質細胞(M1)相關,而普雷沃氏菌_UCG-001與參與神經保護性外周T免疫細胞(Th2)和小膠質細胞(M2)相關[21]。元寶楓籽油的補充可促進神經保護作用的相關菌群,同時抑制神經炎癥相關菌群,有效調節腸道菌群的構成,因此具有開發多種精神障礙的食療資源的潛力。

統計屬水平上豐度前15的菌群的層次聚類熱圖顯示,元寶楓籽油使大鼠腸道菌群組成發生了顯著變化(圖2f)。

2.2 糞便代謝標志物篩選

腸道菌群結構的變化會影響腸道的代謝,采用非靶向脂質組學方法分析兩組大鼠的糞便樣本,并用Progenesis QI 2.0分析糞便代謝物數據,獲得5118個特征化合物。其中正離子模式下53.76%(1 508/2 805)的化合物與脂質或類脂化合物相容的特征性分子種類匹配,在負離子模式下可獲得34.03%(803/2 313)的化合物。正交偏最小二乘判別分析(OPLS-DA)對代謝物進行進一步考察。通過OPLS-DA模型獲S-plot圖(圖3a、圖3c),在P<0.05、處理組/對照組倍數的對數絕對值大于0.5的標準下,獲得差異物火山圖(圖3b、圖3d)。在變量重要性投影(VIP)>1.0,P<0.05條件下處理組第1天可檢出111個顯著差異的代謝物,第7天檢出101個差異代謝物。

注：火山圖中,TRUE(黑色)代表符合篩選標準的代謝物,FALSE(灰色)代表不符合篩選標準的代謝物。

為了找出補充元寶楓籽油變化的核心化合物,基于OPLS-DA的結果提高篩選標準:差異化合物的倍數變化(處理組/對照組)≥1.4或≤0.7,VIP>5.0,最終得到9種代謝物作為標志物,詳見表2。其中,含有C160以及C241支鏈的代謝物可以作為補充元寶楓籽油的糞便生物標志物,即第1天的磷脂酰膽堿(PC)[(241(15Z)/160)],以及第7天的磷脂酰乙醇胺(PE)(140/160)、PC(241(15Z)/160)和PE(160/15∶0)。這些結果表明元寶楓籽油中的成分參與了生物體以及腸道菌群的代謝過程,進而對宿主的生物學進程產生了影響。

表2 糞便標志物

2.3 糞便生物標志物和與腸道菌群的相關性分析

為了解元寶楓籽油補充后腸道菌群和代謝物之間相互作用,進行相關性分析。補充第1天(圖4a),糞便代謝物CE[20∶5(5Z,8Z,11Z,14Z,17Z)]與艾克曼菌、羅姆布茨菌和瘤胃球菌_UCG-013呈顯著正相關(P<0.05),而與Paramuribaculum呈負相關;PC[24∶1(15Z)/16∶0]與乳桿菌屬和Paramuribaculum呈正相關,與羅姆布茨菌和瘤胃球菌_UCG-013呈負相關;乳酰胺B與瘤胃球菌_UCG-014及瘤胃球菌_UCG-013成顯著正相關。補充后PC[24∶1(15Z)/16∶0]是連續出現且含量積累的唯一一種代謝產物,其結構中含有神經酸(C24∶1)脂肪酸鏈。并且顯著關聯的菌群種類最多。因此推測PC[24∶1(15Z)/16∶0]與菌群的調節密切相關。

注:空白框(無球)表示未達到顯著相關性(顯著性為P<0.05)。

第7天(圖4b),PE(14∶0/16∶0)與乳桿菌屬顯著正相關,與羅姆布茨菌顯著負相關;Pitheduloside D與瘤胃球菌_UCG-014和毛螺菌_NK4A136_group均顯著負相關;熊膽酸與艾克曼菌和毛螺菌_NK4A136_group均顯著正相關;PC[24∶1(15Z)/16∶0]與擬桿菌、普雷沃氏菌_UCG-001和普雷沃氏菌_NK3B31_group顯著正相關,與瘤胃球菌_UCG-014、羅姆布茨菌和毛螺菌_NK4A136_group顯著負相關;PE(15∶0/15∶0)與普雷沃氏菌_UCG-001顯著正相關,與Paramuribaculum顯著負相關。4-甲氧基肉桂酰齊墩果酸甲酯和PE(16∶0/15∶0)與菌群均無顯著相關性。

2.4 糞便代謝物和腸道菌群間的相互作用和功能預測

基于KEGG數據庫對屬水平的腸道菌群進行功能預測分析,見圖5。元寶楓籽油補充1 d后,顯著變化的腸道菌群所影響的相關功能主要與代謝疾病、復制與修復、消化系統、代謝、翻譯、免疫系統、核苷酸代謝、信號分子與相互作用、內分泌系統等有關;補充7 d后,顯著變化的菌群與酶家族顯著相關(P<0.1)。

圖5 腸道菌群基于KEGG數據庫的功能預測分析

2.5 糞便標志物影響的代謝通路分析

為了解糞便代謝物的潛在代謝途徑,利用Cytoscape對糞便生物標志物進行網絡分析,將不同的生物標志物及其代謝轉化過程中的關鍵化合物抽象為節點,并用連接來展示不同節點之間的關系,并分析節點間的轉化路徑以及涉及的代謝通路。通過分析可知,顯著變化的8種脂肪酸類代謝物主要通過花生四烯酸代謝、膽汁酸生物合成、甘油磷脂代謝、亞油酸鹽代謝以及磷脂酰肌醇磷酸代謝等途徑進行相互轉化。利用MetaboAnalyst 5.0網站對8個生物標志物進行進一步的通路分析,用于探索元寶楓籽油補充影響的重要生物代謝途徑。由圖6可見,與Cytoscape的處理結果相似,代謝通路(P<0.05),按照P值從小到大排列,分別是甘油磷脂代謝、類固醇生物合成、亞油酸代謝、α-亞麻酸代謝、糖基磷脂酰肌醇-錨定生物合成。

圖6 MetaboAnalyst對糞便標志物的通路分析

聯合糞便生物標志物以及顯著改變的腸道菌群,以及二者各自影響的通路及功能,構建了代謝物-菌群-代謝通路相互作用網絡(圖7)。在腸道菌群方面,糞便代謝物的產生主要與10種細菌(乳桿菌屬、艾克曼菌、瘤胃球菌_UCG-014、羅姆布茨菌、擬桿菌、普雷沃氏菌_UCG-001、毛螺菌_NK4A136、瘤胃球菌_UCG-013、Paramuribaculum、普雷沃氏菌_NK3B31)相關。這些菌群主要參與涉及代謝疾病、復制、修復、消化系統、代謝、翻譯、免疫系統、核苷酸代謝、信號分子和相互作用、內分泌系統和酶家族等代謝路徑。而這些菌群通過與糞便標志物與花生四烯酸代謝、膽汁酸生物合成、甘油磷脂代謝、亞油酸代謝和磷脂酰肌醇磷酸代謝有關。甘油磷脂已被證明在神經細胞中發揮結構和功能作用[29]。前期研究報道補充元寶楓籽油能提高動物的學習和記憶能力[16],因此實驗中甘油磷脂代謝和花生四烯酸代謝的改變可能與補充元寶楓籽油后的大鼠神經系統的調節有關。有研究報道在小鼠上,甘油磷脂代謝異常與阿爾茲海默病相關[30];花生四烯酸代謝參與神經的早期發育[31]并對氧化應激發揮保護作用[32]。此外,Zellweger綜合征也與膽汁酸合成途徑有關[33]。

注:實線、虛線分別代表代謝物和微生物之間的正相關、負相關

3 結論

通過聯合16S rDNA測序和LC-QTOF-MS的脂質組學技術,評估了膳食補充元寶楓籽油對大鼠腸道菌群和代謝物的影響。研究發現元寶楓籽油的攝入可引發大鼠腸道菌群結構的重塑,相關性分析顯示這種變化與含有神經酸(C24∶1)支鏈的代謝物——PC[24∶1(15Z)/16∶0]密切相關。菌群結構的變化分析暗示與神經系統的部分功能相關。結果顯示元寶楓籽油具有調節改善腸道菌群的效應,可能通過腸-腦軸對神經系統產生保護作用。