萌發對藜麥蛋白質結構與功能特性的影響

郭思倩, 楊肇興, 姚 洋, 吐魯洪·托乎提, 李夢陽, 李夢卿, 杜雙奎,2

(西北農林科技大學食品科學與工程學院1,楊凌 712100) (糧油功能化加工陜西省高校工程研究中心2,楊凌 712100)

藜麥(ChenopodiumquinoaWilld),又稱南美藜、印第安麥、奎藜等,最早發現于南美洲的安第斯山脈,是當地居民的主食。近幾年,藜麥因其農業潛力和營養特性吸引全球學者的關注。藜麥蛋白質質量分數高達12%～23%,且富含人體生長所需的9種必需氨基酸[1, 2],其精氨酸、蛋氨酸、賴氨酸含量高于小麥[3]、燕麥[4]、蕎麥[5]等谷物。藜麥蛋白屬于完全蛋白質,其氨基酸比例與聯合國糧食與農業組織(FAO)提出的理想比例接近,被公認為是唯一一種可提供人體所需全部營養物質的糧食單作物[6]。藜麥蛋白主要由清蛋白和球蛋白組成,還含有較多的谷蛋白[7];其中清蛋白具有較好的溶解度、起泡性、乳化特性和抗氧化活性;球蛋白因其二硫鍵和特有的球狀結構,具有良好的凝膠能力,但溶解性較差[8]。

藜麥在食用前通常需要進行加工,用擠壓、膨化、壓片等方式將其制成理想的商品[9]。近期有越來越多學者提出應通過減少劇烈的熱加工和機械過程來保持谷物優良的營養特性[10]。萌發因低成本、低耗能、成品風味多樣化而被視為理想的谷物加工方法已并被廣泛應用[11]。此外,有學者將萌發應用于豆干制品加工,發現經過萌發處理,大豆中的蛋白質、維生素C、大豆異黃酮等營養物質含量顯著增加,豆干的感官品質得到明顯改善[12]。高道葉[13]采用萌發的方式、利用冷水蒸汽提高發芽罐中的濕度,解決了傳統浸泡工藝制取發芽糙米過程爆腰率過高的問題,有效提升其食用品質。將蕎麥[14]、青稞[15]萌發處理可制得富含γ-氨基丁酸的谷物粉,提升其營養價值。可見萌發在食品工業中具有廣泛的應用價值。

籽粒萌發時,儲藏蛋白會在蛋白酶的催化作用下分解成氨基酸或小分子質量多肽,使其具有更好的生物效用[16]。與傳統的物理、化學及酶法改性相比,萌發具有安全性、環保、費用低廉、易處理等優點,是一種理想的水解和合成新的蛋白質(釋放小分子肽一起合成新的蛋白質)的方式[11,17,18]。目前國內外關于萌發對藜麥蛋白質的影響多數停留在藜麥總蛋白含量、蛋白質組分含量以及氨基酸含量動態變化的研究上,涉及萌發對蛋白質結構的影響研究較少,萌發對蛋白質結構和功能特性的影響有待進一步探討。為此,研究以甘肅白藜麥為原料,對其進行0～72 h的萌發處理,探討萌發過程中藜麥蛋白質功能特性及結構特性的變化,以期通過萌發提高藜麥蛋白質的利用率,改善其營養價值和加工特性,為其在食品加工領域的應用提供指導。

1 材料與方法

1.1 實驗材料與試劑

白藜麥原糧產自甘肅;大豆油為一級大豆油(900 mL);SDS-PAGE預制膠、蛋白質Marker、考馬斯亮藍蛋白膠快速染色液;氫氧化鈉、鹽酸、SDS、十二水合磷酸氫二鈉、二水合磷酸二氫鈉等均為分析純;溴化鉀為光譜純。

1.2 實驗儀器與設備

食品級PP加密格育苗盤,XHF-X型高速分散器,LGJ-10C型冷凍干燥機,SC-2546型低速離心機,KDC-40低速離心機,L-530低速離心機,PB-10酸度計,BSA223S型電子天平,FA2004C型電子天平,FW100型高速粉碎機,UV-1200型紫外可見分光光度計,Ls55型熒光分光光度計,Q2000型差示掃描量熱儀,Vetex-70型傅里葉變換紅外光譜儀,Power pac HC型電泳儀,GE1DOC XR+型凝膠成像系統。

1.3 實驗方法

1.3.1 藜麥萌發實驗

將新鮮藜麥挑揀、除雜后,清洗浸泡3 h,置于方形育苗盤中,于室內通風處萌發,實驗于3月開展,室內平均溫度為20 ℃,每12 h用蒸餾水淋洗1次,在萌發0、24、48、72 h取樣,同時采用5點法取樣測定藜麥幼芽的長度,結果如表1。樣品于50 ℃干燥,粉碎、過60目篩得到萌發藜麥粉。

表1 萌發時間對藜麥芽長的影響

1.3.2 藜麥蛋白提取

采用堿溶酸沉法提取蛋白[19]。將萌發藜麥粉用石油醚進行脫脂,將脫脂粉按料液質量比1∶15添加蒸餾水,用1 mol/L NaOH溶液調節pH至9.0,3 800 r/min離心30 min收集上清液,重復提取2次;用1 mol/L鹽酸調節pH至4.5,沉淀30 min,3 800 r/min離心30 min,收集沉淀。蛋白質沉淀加少量蒸餾水復溶,用1 mol/L NaOH調節pH至7.5,冷凍干燥,-20 ℃冷藏備用。

1.3.3 藜麥蛋白含量測定

參照GB/T 5009.5—2010凱氏定氮法進行測定。

1.3.4 結構特性測定

1.3.4.1 熱學特性測定

稱取2 mg藜麥蛋白,加入6 μL蒸餾水,密封壓蓋。于-20 ℃靜置平衡過夜,用差示掃描量熱儀掃描:氮氣流速為50 mL/min,掃描溫度30～150 ℃,升溫速率為10 ℃/min,空白對照為空鋁盒。

1.3.4.2 內源性熒光光譜測定

用0.01 mol/L、pH 7.0磷酸緩沖液配制0.2 mg/mL樣品溶液。熒光分光光度計參數設置:激發波長λex=295 nm,掃描范圍300～400 nm,狹縫5 nm。

1.3.4.3 表面疏水性測定

采用ANS熒光探針法[19]。用0.01 mol/L、pH 7.0的磷酸鹽緩沖液配制不同的質量濃度梯度(0.0625～1.0 mg/mL)的樣品溶液。取各質量濃度樣品溶液5 mL,加入25 μL 8 mmol/L的ANS溶液(磷酸緩沖液配制),振蕩混勻,避光靜置15 min。用熒光分光光度計測定熒光強度:激發波長λex=390 nm,發射波長λem=470 nm,狹縫5 nm,掃描速度1 000 nm/min。以熒光強度為縱坐標、蛋白質質量濃度為橫坐標作圖,通過線性回歸分析計算初始段斜率,即為樣品的表面疏水性指數。

1.3.4.4 SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳

取60 μL 1 mg/mL樣品溶液,加入20 μL上樣緩沖液,混勻,90 ℃金屬浴加熱10 min,冷卻。上樣量為30 μL,電壓110 V,時間70 min。用考馬斯亮藍蛋白膠快速染色液染色后,洗凈背景,用凝膠成像系統拍攝電泳圖譜。

1.3.5 功能特性測定

1.3.5.1 溶解度測定

參照張文剛等[20]的方法,并稍作修改。配制1 mg/mL樣品溶液,測定蛋白質含量C0,渦旋1 min,3 800 r/min離心15 min,測定上清液蛋白質含量C。蛋白質含量用紫外吸收法測定[19],分別測定蛋白質溶液在280 nm和260 nm下的吸光值A280 nm和A260 nm,按公式計算:

C=1.45A280 nm-0.74A260 nm

式中:C為上清液蛋白質質量濃度/mg/mL;A280 nm為蛋白質溶液在280 nm下的吸光值;A260 nm為蛋白質溶液在260 nm下的吸光值;C0為樣品溶液蛋白質質量濃度/mg/mL。

1.3.5.2 乳化性及乳化穩定性測定

參考付嘉陽等[21]的方法。用0.1 mol/L、pH 7.0的磷酸緩沖液配制1 g/mL樣品溶液。取6 mL樣品溶液,加入2 mL大豆油,混合,在室溫下用高速分散機10 000 r/min高速剪切1 min,靜置,分別在0、10 min時迅速從容器底部取出50 μL樣品溶液,加入5 mL 0.1 g/mL SDS,混勻后于500 nm測吸光度A0、A10。空白對照為0.1 g/mL質量濃度SDS。乳化性(EAI)和乳化穩定性(ESI)按公式計算:

式中:EAI為乳化性/m2/g;ESI為乳化穩定性/min;T為換算常數2.302;N為稀釋倍數;C為蛋白質的質量分數/g/mL;ψ為大豆油的體積分數,0.25;Δt為靜置時間差,10 min。

1.3.5.3 起泡性和泡沫穩定性測定

參考付嘉陽等[21]的方法,并稍作修改。稱取0.15 g樣品于離心管中,加入15 mL蒸餾水,于10 000 r/min高速攪打2 min,采用刻度尺記錄攪打前、后分散液體積,靜置30 min再次記錄體積。起泡性(FC)及泡沫穩定性(FS)按照公式計算:

式中:FC為起泡性/%;FS為泡沫穩定性/%;V1、V2、V3分別為攪打前、后及靜置30min后的分散液體積/mm。

2 結果與分析

2.1 萌發時間對藜麥粉蛋白質含量的影響

萌發時間對藜麥粉蛋白質含量的影響見圖1。隨著萌發時間的延長,藜麥粉的蛋白質含量呈現增大趨勢,萌發處理后的藜麥粉的蛋白質含量顯著提高(P<0.05),這與韓雅盟等[22]研究結果一致。分析原因,在萌發過程中,藜麥種子生長發育需要消耗供能物質淀粉,新陳代謝提高,導致其總干基質量降低,從而使得蛋白質含量相對增加[22];新生長的芽中也會合成新的蛋白質[23],同時蛋白質作為儲能物質也會被消耗,隨著萌發時間的延長,藜麥蛋白質含量在生成和分解的過程中不斷變化,且總體呈上升趨勢。所以,萌發處理可以提高藜麥的蛋白含量,并且在72 h內,萌發時間越長,蛋白質含量越高。

注:圖中字母表示顯著性水平(P<0.05)。下同。

2.2 萌發時間對藜麥蛋白結構特性的影響

2.2.1 熱學特性

表2為萌發藜麥蛋白質的熱變性起始溫度T0、峰值溫度Tp、終止溫度Te和焓值ΔH。萌發后藜麥蛋白存在2個熱變性區間,峰值溫度分別為99～108、119～138 ℃,溫度范圍跨度較大,可能是由藜麥球蛋白和清蛋白的復雜組成引起的[24]。與未經萌發處理(萌發0 h)的藜麥蛋白相比,萌發藜麥蛋白熱變性峰值溫度Tp顯著增大(P<0.05)。經萌發處理后藜麥蛋白質的熱穩定性顯著提高。較高的熱穩定性有益于藜麥在需高溫加熱食品中的應用。隨著萌發時間的延長,藜麥蛋白的熱變性焓值ΔH快速下降,在萌發72 h時幾乎為0。說明在萌發過程中藜麥蛋白三級結構遭到破壞,蛋白質發生變性,且萌發時間越長,變性蛋白質占比越高。

表2 萌發時間對藜麥蛋白熱特性參數的影響

2.2.2 內源性光譜

內源性熒光光譜中的最大吸收波長(λmax)與蛋白中芳香族氨基酸殘基所處的微環境有關,本研究掃描范圍為300～400 nm,主要以色氨酸(Trp)作為內源探針觀測蛋白質結構的變化情況[25]。圖2為萌發藜麥蛋白的內源性熒光光譜圖。可以看出,萌發0 h時,藜麥蛋白的λmax為343 nm,此時Trp多分布在蛋白質分子表面,其分子間的作用力限制了Trp與水分子的接觸[26];隨著萌發時間的延長,最大吸收波長發生紅移,λmax增大,這表明萌發處理后Trp逐漸暴露在極性環境中,蛋白質空間結構發生改變,疏水性降低[25];隨著萌發的繼續進行,萌發藜麥蛋白質的最大熒光強度逐漸降低,這可能與位于蛋白質表面的Trp逐漸被氧化、數量減少有關[26]。

圖2 萌發藜麥蛋白的內源性熒光光譜

2.2.3 表面疏水性

表面疏水性體現了蛋白質表面氨基酸的疏水作用,對蛋白質的功能特性有重要影響。萌發藜麥蛋白的表面疏水性指數變化如圖3所示,隨著萌發的進行,藜麥蛋白的表面疏水性指數顯著降低(P<0.05)。在萌發過程中,為滿足植株生長發育的需求,部分藜麥蛋白質將被酶水解,蛋白質結構發生改變,包埋在分子內部的氨基酸殘基被暴露出來并發生氧化,導致蛋白質表面的疏水性氨基酸殘基數量減少,使得ANS與蛋白質結合的數量降低,最終表現為表面疏水性的降低[5]。許英一等[27]研究發現熱處理改性燕麥蛋白的表面疏水性和內源性熒光強度呈極顯著的線性正相關,許晶等[27]研究發現大豆分離蛋白的溶解性與表面疏水性呈顯著負相關。隨著萌發時間的增加,藜麥蛋白的表面疏水性與內源性熒光強度均呈下降趨勢,溶解度呈上升趨勢,這與許英一等[27]、許晶等[28]的研究結果一致。

圖3 萌發時間對藜麥蛋白表面疏水性指數的影響

2.2.4 SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳

藜麥中儲存蛋白主要由2S清蛋白(35%)和11S球蛋白(37%)組成,均通過二硫鍵維持蛋白質分子的穩定性[29]。SDS-PAGE結果表明,在萌發48 h前,亞基條帶數目不變,但部分亞基條帶的強度(相對含量)卻有顯著的改變(圖4)。在未萌發的藜麥蛋白質中,發現條帶中顯示出了A亞基(酸性亞基,32～39 ku)、B亞基(堿性亞基,22～23 ku)、清蛋白(108～9 ku)。其中,20～23 ku和32～39 ku的條帶最為顯著,即這2個亞基的相對含量最高,與張文剛等[20]報道分析結果一致。分子質量為100、57、32～39 ku的亞基相對含量均呈下降趨勢,在萌發72 h時幾乎消失,而分子質量為20～23、10～12 ku 的亞基相對含量較高。這可能是因為蛋白質參與了藜麥的萌發過程,高分子質量的蛋白質被蛋白質分解酶分解為較低分子質量的蛋白質[5, 7]。也有可能是由于蛋白質被分解成足夠小的碎片,逃逸出凝膠,考馬斯藍染色無法檢測到[30]。

圖4 萌發藜麥蛋白的SDS-PAGE分析圖譜

2.3 萌發時間對藜麥蛋白功能特性的影響

2.3.1 溶解度

由表3可知,藜麥蛋白質的溶解度隨萌發時間的延長呈升高趨勢(P<0.05),在萌發72 h時,藜麥蛋白的溶解度達到最高(95.9%)。這是由于萌發處理后藜麥蛋白質的結構發生改變,其表面的疏水性氨基酸殘基數量減少、表面疏水性降低,故蛋白質的溶解度升高。同時,在藜麥萌發過程中,由于種子呼吸代謝,在內源酶作用下存在蛋白質的分解和新蛋白的合成,而組成和結構的改變可能使得蛋白質具有更好的親水性,溶解度升高[19]。蛋白質的溶解度是其發揮營養價值和功能特性的基礎,萌發處理可改善藜麥蛋白的溶解度,有利于藜麥蛋白制品的開發。

表3 萌發時間對藜麥蛋白功能特性的影響

2.3.2 乳化性及乳化穩定性

乳化性是指將油相和水相混合形成乳化液的能力。利用蛋白的乳化性,可以將其用于生產冰淇淋類食物以及化妝品、包裝材料等某些化工產品[8]。從表3可以看出,萌發顯著提高了藜麥蛋白的乳化能力(P<0.05)。隨著萌發時間的延長,藜麥蛋白的乳化性迅速增大,在萌發72 h時,達到最高(27.83 m2/g),比未萌發的藜麥蛋白提高了1.4倍。這是由于萌發過程中藜麥蛋白質溶解度增加,能到達油-水界面的蛋白質顆粒增多,乳化性提升[7];并且在萌發過程中蛋白質組成和結構發生變化,當暴露高數量的疏水基團時,乳液中乳化劑和油滴之間的結合能力變強,疏水基團的增加改善了油-水界面的分子排列,從而提高了加工過程中的乳化性[21]。

乳化穩定性是表征乳濁液保持乳濁狀態的能力。由表3得知,隨著萌發時間的延長,藜麥蛋白的乳化穩定性迅速升高(P<0.05),萌發72 h時藜麥蛋白乳化穩定性達到最高值68.59 min,比未萌發的藜麥蛋白提高了4.2倍。這可能是萌發過程中蛋白質結構伸展,暴露更多疏水氨基酸,蛋白質表面活性及柔性增強,改善了乳化穩定性[19]。同時,萌發藜麥蛋白在蛋白酶的作用下界面特性部分發生改變,并且伴隨著新蛋白的生成,一些新蛋白或蛋白亞基在油-水界面上相互作用更緊密,界面強度提高,使乳化穩定性得以改善[7]。此外,酶解、去皂化以及其他成分(如糖蛋白)會影響蛋白質乳化性質的表現[31]。

2.3.3 起泡性和泡沫穩定性

蛋白質的起泡性與其組成結構、蛋白濃度、蛋白質膜的流變性等有關,可以賦予食品蓬松柔軟的質感和良好的口感[19]。由表3可知,萌發處理對藜麥蛋白的起泡性及泡沫穩定性有顯著影響(P<0.05)。隨著萌發時間的延長,藜麥蛋白的起泡性呈下降趨勢,泡沫穩定性則先上升后下降,在萌發24 h時達到最大值(95.39%)。分析原因,隨著萌發的進行,部分藜麥蛋白質水解形成分子質量較小的亞基結構,藜麥蛋白可溶性提高,使其在空氣-水界面具有更好的吸附能力,改善了藜麥蛋白的泡沫特性[19]。而藜麥蛋白起泡性呈逐漸下降的趨勢,可能是由于蛋白質的起泡性與蛋白質濃度有關。有研究表明,隨著蛋白質濃度的增大,樣品溶液的黏度也增大,有利于泡沫的形成;但當蛋白質濃度過大時,溶液黏度也過大,則不利于泡沫的形成,起泡性逐漸降低[32]。

3 結論

經過萌發處理,藜麥粉的蛋白質含量顯著提高,萌發藜麥蛋白的熱穩定性提高,起泡性降低,可用于蛋糕、面包等食品加工,增加營養、豐富口感;溶解度、乳化性和乳化穩定性增大,表面疏水性減弱,可更好地應用于冰淇淋、乳制品等加工;萌發藜麥蛋白的空間結構發生明顯變化,萌發藜麥蛋白的大分子亞基數量減少而小分子亞基數量增加。萌發使得藜麥蛋白具有更好的加工性能,是一種值得推廣的加工方法。